Construction of Prokaryotic Expression Vector of Mouse Nanog Gene and Its Expression

The aim of this study is to construct a prokaryotic expression vector of mouse Nanog gene and to express it in E. coli. A pair of primers was designed according to digestion sites in plasmid pGEX-KG and the Nanog gene sequence published by GenBank. The DNA fragment of 918 bp was amplified by polymerase chain reaction （PCR） from the pNA992 recombinant plasmid with Nanog gene, then cloned into pGEX-KG and transformed into the host E. coli strain TG Ⅰ. The sequence of the fragment was matched with the original sequence of pNA992. It indicated that fusion expression vector, pGEX-KG- Nanog, was constructed successfully. The pGEX-KG-Nanog plasmid was extracted from E. coli strain TG Ⅰ and was transformed into BL21（DE3） for expression. After induction by isopropyl-β-D-thiogalactoside （IPTG） at 37℃, the expression product of Nanog gene was identified by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE）, and the expression condition was optimized. Nanog fusion protein was successfully expressed in the form of inclusion bodies. The molecular weight of the inclusion body was 63 kDa. Meanwhile, the optimum condition for the expression of Nanog fusion protein was induced with 0.8 mmol L^-1 IPTG for 5 h. The mouse Nanog gene was successfully expressed in E. coli, which laid a foundation for the purification of Nanog protein and for the preparation of polyclonal antibody.     

不同浓度重铬酸钾溶液胁迫对洋葱根尖生理生化特性的影响

研究不同浓度重铬酸钾溶液及不同处理时间对洋葱(Allium cepa L.)根尖细胞有丝分裂和植物保护酶系统的影响,旨在为探究重金属铬作用于植物体的生理生化机理提供参考。分别用0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 mg/L重铬酸钾溶液处理洋葱根尖6、12、18、24 h,而后收集洋葱根尖组织,分别用于洋葱根尖组织石蜡切片、苏木素染色观察和测定根尖细胞中的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽-S转移酶活性及丙二醛含量。结果表明,不同浓度重铬酸钾溶液处理洋葱根尖不同时间后,细胞有丝分裂出现异常分裂,并伴有微核的产生;无论处理时间长短,随着处理浓度的增加,细胞中的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽-S转移酶活性都呈现先上升、后下降的变化趋势,而丙二醛含量先缓慢下降、后迅速上升;当处理浓度一定时,随着处理时间的延长,细胞中的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽-S转移酶活性呈上升趋势,而丙二醛含量呈缓慢下降趋势。说明重铬酸钾溶液对洋葱具有一定的细胞毒性作用,可能与调控细胞中各种酶系统的活性及含量有关。     

喜马拉雅旱獭弓形虫病血清学检测

用弓形虫的重组蛋白GST-SAG1作为ELISA诊断抗原,采用ELISA检测方法,对青海省祁连县喜马拉雅旱獭血清进行了弓形虫病的血清学检测。结果表明,被检92份喜马拉雅旱獭共检出阳性血清25份,阳性率约为27.17%。结果提示,青海省祁连县的喜马拉雅旱獭中存在弓形虫病的感染。     

发酵乳中SOD、CAT、GSH-Px、GST活性的变化

10份鲜牛乳98℃煮沸5min后,用乳酸菌发酵制作酸乳。测定了发酵前后乳中SOD、CAT、GSH-Px、GST的变化。发酵前4种酶的活性分别为:45.68±7.81、1.46±1.78、156.67±37.51(GSH-PX活力单位),65.81±25.47;发酵后各酶的活性分别为73.47±5.27、0.44±0.50、0、5.42±3.25。发酵乳SOD活性升高60%多,CAT降低近73%,GST降低近92%,GSH-Px活性全部丧失(P<0.01)。     

利用 GST pull-down 联合质谱技术鉴定H7N9 禽流感病毒 PA-X 的互作蛋白

[目的]为探究H7N9亚型禽流感病毒(AIV)PA-X蛋白的功能,采用GST pull-down联合质谱技术筛选与鉴定与PA-X相互作用的宿主蛋白.[方法]构建PA-X的重组表达载体pGEX-4T-PA-X,转化大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白,并利用GST亲合树脂进行纯化得到GST-PA-X融合蛋白.利用GST pull-down技术,将GST-PA-X和GST对照蛋白分别与A549细胞裂解液总蛋白进行体外孵育,得到的蛋白复合物经SDS-PAGE分离后进行质谱检测分析.[结果]经GST pull-down筛选与质谱分析鉴定后得到39个高可信度的可能与PA-X互作的候选蛋白质.通过GO注释和KEGG等通路富集分析发现,这些蛋白主要参与RNA的代谢及加工、mRNA翻译及运输、多肽生物合成及基因表达的转录后调节等生物学过程.对其中评分最高的蛋白Hsp70-2与PA-X的相互作用作进一步验证,免疫荧光试验结果表明Hsp70-2与PA-X可以在细胞浆中共定位.[结论]利用GST pull-down联合质谱技术筛选到39种与PA-X互作的候选蛋白,且经免疫荧光试验证明候选蛋白Hsp70-2与PA-X存在共定位,为深入探讨PA-X在AIV生命周期中的作用机制奠定基础.     

长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2互作蛋白的筛选与验证

【目的】筛选长足大竹象(Cyrtotrachelus buqueti)信息素结合蛋白CbuqPBP2的互作蛋白，为实现利用信息物质对长足大竹象种群持续控制提供参考。【方法】利用GST pull-down联合质谱技术，对长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2的互作蛋白进行筛选、鉴定和分析，并采用酵母双杂交试验验证了CbuqPBP2与信息素结合蛋白CbuqPBP1的特异性互作。【结果】GST pull-down共筛选出45个与长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2特异性结合的候选互作蛋白，包括CbuqPBP1、ND2、CYTB。这些互作蛋白主要参与细胞过程、定位、代谢过程、应激反应以及生物调控等多个生物学过程。使用酵母双杂交体系，构建了pGADT7-PBP1 重组猎物质粒与pGBKT7-PBP2 重组诱饵质粒，通过诱饵质粒毒性检测和自激活检测，表明重组诱饵质粒对Y2HGold酵母菌无毒性作用。共转化验证结果显示，诱饵质粒pGBKT7-PBP2共转化酵母菌株能够在TDO 培养基上生长。【结论】CbuqPBP2和CbuqPBP1之间有相互作用，不同信息素结合蛋白间的互作对深入理解长足大竹象嗅觉感受机制提供了新的思路。