口蹄疫病毒AF72株 3D聚合酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用RT—PCR方法扩增口蹄疫病毒（FMDV）AF72株的3D聚合酶基因,并将其克隆至pGEM—Teasy载体,测序分析结果表明,AF72 3D聚合酶基因与GenBank中公布的其他4个参考序列均具有较高的同源性。将目的基因插入原核表达载体pET-30a（＋）中,构建了重组表达质粒pET-3D,鉴定后转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导,3D聚合酶基因在大肠杆菌中获得了正确表达,目的蛋白的分子量为46ku。Western blot检测结果显示,表达产物可以与抗A型FMDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。     

绿鳍马面鲀雌雄性腺转录组比较分析

为探明绿鳍马面鲀(Thamnaconus septentrionalis)性腺发育相关基因表达特征,优化亲本生殖调控技术,本研究对绿鳍马面鲀雌雄亲体的精巢和卵巢进行了转录组测序分析,经de novo拼装,最终获得119 219个单基因(unigene),N50长度为1 255 bp。在NR、NT、KO、SwissProt、PFAM、GO及KOG数据库分别注释到24 009、35 057、18 453、26 971、30 294、11 420和21 613个unigene。绿鳍马面鲀精巢和卵巢转录组中存在18 954个差异表达基因(DEG),相对于精巢,在卵巢中上调表达的基因有11 265个,下调表达的有7 689个。选取bmp2、sox3、figla、hsd17b1、cyp19a、cyp17、foxl2、star和amh 9个DEGs进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR)验证,结果显示,qRT-PCR结果与RNA-Seq分析相一致。GO和KEGG富集结果分析发现,amh、cyp17和star可能在绿鳍马面鲀雄性精子发生过程中起关键作用;bmp2、foxl2、cyp19a、figla和hsd17b1在雌性卵子发生和卵巢类固醇生成过程中发挥重要作用。本研究通过比较绿鳍马面鲀精巢和卵巢的转录组表达差异,初步阐明了精巢和卵巢的基因表达特征,为进一步研究绿鳍马面鲀的性腺发育机制奠定了基础。     

盐生草Actin基因片段的克隆及表达

根据藜科植物的肌动蛋白（Actin）基因编码区保守序列设计一对简并引物,提取盐生草（Halogeton glomeratus）叶片的总RNA,运用RT-PCR技术扩增出Actin基因的核心序列并连接到pMD19-T载体,阳性克隆经PCR检测后进行测序。序列分析表明,盐生草Actin基因核心序列长度为598 bp,编码198个氨基酸,并在GenBank中注册,登录号为KF699314,由盐生草Actin基因推导的氨基酸序列与其他几种耐盐植物的同源性均在94%以上,具有高度的保守性。采用荧光定量RT-PCR技术分析其Actin基因在盐生草不同器官的表达情况,结果显示其表达量恒定无差异,表明克隆的Actin基因可作为盐生草内参基因来研究其相关耐盐基因的表达。     

鱼类抗病育种研究进展

为探究稀有鮈鲫MHC Ⅱβ基因的分子特征及其表达特点,采用PCR扩增技术获得了稀有鮈鲫MHC Ⅱβ cDNA序列810 bp,包括开放阅读框 (ORF)759 bp,编码252个氨基酸。生物信息分析表明,MHC Ⅱβ氨基酸序列存在4个保守的半胱氨酸残基和GXXGXXXGXXXXXXG结构,与其他亲缘鱼类的一致性为51.78%~80.56%,其编码的蛋白质分子包括1个信号肽、1个MHC Ⅱβ (β-1)结构域、1个IGc1 (β-2)结构域和1个跨膜螺旋区域。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)结果显示,MHC Ⅱβ在脾脏表达量最高,头肾、鳃、皮肤表达量较高。人工感染鲁氏耶尔森菌后,6 h时在头肾表达呈显著上调,肝脏中在12 h开始出现极显著上调,皮肤中在24 h和48 h表达极显著,鳃中在6~24 h表达极显著,脾脏中则是在6 h出现极显著下调,于96 h接近对照组表达水平。初步研究表明,MHC Ⅱβ在鱼类抵御细菌感染的免疫反应中发挥着重要作用,为进一步揭示稀有鮈鲫MHC家族的功能提供了参考依据。

     

Cyclin-CDK-CKI及UPP参与生殖调控及在甲壳动物性腺发育中的研究进展

泛素-蛋白酶体系统作为重要的蛋白质修饰途径,参与多个生物学过程,其中泛素结合酶E2作为关键酶可以决定泛素化对靶蛋白的影响。为了探究泛素结合酶E2在半滑舌鳎雌性性腺发育中的作用,本研究克隆了半滑舌鳎Cs-UBE2D4基因的开放阅读框ORF,检测了该基因在不同组织和不同发育阶段性腺中的表达模式;构建了其启动子报告基因载体(pGL3-Cs-UBE2D4)并进行了启动子活性分析。Cs-UBE2D4开放阅读框为360 bp,编码119个氨基酸,含有保守的泛素结合酶E2结构域。荧光定量PCR结果显示,Cs-UBE2D4在雌鱼的各组织中广泛表达,其中在卵巢和肝脏中表达量较高,而在雄鱼中几乎检测不到表达;在卵巢各发育阶段中,该基因的表达量从90日龄开始上调,6月龄达到峰值,之后开始下调,在1.5龄时表达量最低,在3龄时表达量有所回升,其中6月龄表达量为90日龄表达量的1.97倍。双荧光素酶活性检测结果显示,Cs-UBE2D4启动子具有较强的转录活性。本实验将为进一步开展Cs-UBE2D4基因对半滑舌鳎卵巢发育和性别调控相关机制的研究提供理论依据。     

中国沿海互花米草遗传多样性及其遗传结构

扩增互花米草(Spartina alternifora)叶绿体trnT-trnL和线粒体nad1两个基因片段,采用PCR产物直接测序法,测定中国沿海地区20个样点的基因序列,并根据互花米草的表型差异将中国沿海互花米草划分为南部、中部和北部3个种群,探讨不同种群互花米草的遗传结构和遗传多样性。结果表明,这两个基因片段的3个多态性位点可将中国沿海地区互花米草分为4种单倍型,种群的单倍型多样性指数(Hd)为0.189,Indel单倍型多样性指数(Indel Hd)为0.542,多样性全部来自种群内部;各种群的遗传距离平均值为0.028,南部种群和北部、中部种群之间基因分化系数(Gst)分别为0.015 82、0.004 15,固定指数(Fst)均为0。本研究表明,中国沿海地区互花米草遗传多样性低,具有明显的瓶颈效应,南部、中部和北部3大种群没有发生遗传分化,推测可能是表型可塑性在3大种群的表型变异上起了更大作用。另外,本研究还指出上海崇明岛互花米草种群在遗传水平上具有一定的特殊性。     

甘菊CBL基因的克隆与表达分析

基于已建立的甘菊ESTs文库,检索到了CBL基因4个不同的EST序列;采用RACE技术获得了它们的全长序列,并命名为ClCBL1-4。将甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)ClCBL与拟南芥(Arabidopsis thaliana)的CBL进行多重序列比对发现,它们都含有4个结合钙离子的EF-hand结构域,且ClCBL1在N端有一个豆蔻酰化序列(MGCXXSK/T)。采用RT-PCR技术,分析了甘菊中CBL基因的表达与不同逆境胁迫的关系,表明甘菊CBL基因的表达在冷、干旱、热、盐及ABA胁迫中可被不同程度地诱导,而在非逆境胁迫条件下,甘菊CBL基因在根、茎、叶及花等不同器官中均有表达,且表达量相对一致。这些结果说明该家族基因参与了植物非生物逆境胁迫的抵御。     

番茄抗番茄斑萎病毒病育种研究进展

番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV）是危害番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）最重要的病原菌之一,在中国及世界范围内已成为限制番茄生产的重要因素。利用自然番茄抗病资源及抗病基因是控制TSWV的有效方法。秘鲁番茄（Lycopersicon peruvianum Mill.）和智利番茄（Lycopersicon chilense Mill.）等野生番茄是目前发现的抗TSWV的主要自然资源。其中,秘鲁番茄中的显性抗病质量基因位点Sw-5在TSWV抗病遗传育种中发挥重要作用。后续开发和培育了多种与Sw-5连锁的分子标记及含有Sw-5的抗病品种。除此之外,病毒RNA介导基因沉默技术在番茄TSWV抗病育种中也逐渐受到重视。由于目前陆续出现了打破Sw-5基因位点的TSWV分离种,因此今后的工作亟须发掘TSWV新的抗病资源和基因。     

RNA干扰技术及其在烟草中的应用研究进展

基因工程技术近年来在作物研究领域发展迅速,RNA干扰（RNAi）作为一项重要的基因沉默技术,具有高效性且特异性强的显著特点,现已广泛应用于后基因组时代,对研究作物基因功能,抗性和品质改良等有着重要作用。中国烟草研究已进入基因组时代,随着烟草基因组测序的开展,RNAi作为一门反向遗传学技术在烟草中的应用越来越多。本文介绍了RNAi 技术的作用机制和特点,重点介绍了RNAi在烟草基因功能研究、抗病研究、抗虫研究及烟草品质改良研究中的应用,并对RNAi 技术在烟草中的应用前景进行了展望。     

基于转录组的疏花软紫草低拷贝核基因引物开发

基于高通量的转录组测序,为大量并快速的开发分子标记提供契机。本研究对紫草科植物疏花软紫草进行转录组测序,共得到92042086条reads,从疏花软紫草158446个Unigene中搜索到332个低拷贝核基因。为进行多态性验证,从中随机挑选30个设计引物,并对3个疏花软紫草种群共9个个体进行PCR扩增,结果发现其中16对引物能够扩增出单一稳定的目的条带,从中随机挑选7个片段进行群体测序并计算DNA多态性。结果表明,7对引物的多态性位点平均值为657,单倍型平均值为514,单倍型多态性 （HD） 在0389~0944之间,核苷酸多态性 （Pi） 为000148~001723。通过转录组测序技术开发的低拷贝核基因有较高的多态性,且可以有效地运用于群体遗传学和谱系地理学研究中。另外,这些低拷贝核基因能够被运用于软紫草属植物系统发育重建以及物种形成等研究工作中。