大鲵虹彩病毒贵州分离株MCP基因的克隆与原核表达

根据Gen Bank中大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白MCP(major capsid protein,MCP)基因序列(序列号:KF512820),设计一对特异性引物,以大鲵虹彩病毒贵州分离株基因组DNA为模板,PCR扩增大鲵虹彩病毒MCP基因并测序,与Gen Bank中大鲵虹彩病毒MCP基因进行比对,然后将其亚克隆到原核表达载体p ET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后进行Western blot分析。结果显示:PCR扩增出长度为1 392 bp的片段,与Gen Bank中大鲵虹彩病毒MCP基因核苷酸序列相似性为99.7%~99.9%,SDSPAGE电泳显示该重组蛋白的相对分子质量约为67×103。免疫原性检测结果表明,该重组蛋白可与兔抗大鲵虹彩病毒阳性血清特异性反应,具有免疫原性。     

凡纳滨对虾细胞因子信号转导负调控因子 基因(Lv-SOCS)的克隆及特征分析

为了探讨凡纳滨对虾细胞因子信号转导负调控因子(SOCS)在病毒引发的免疫应答过程中的潜在作用,本实验根据前期的转录组和表达谱结果提示信息,首次克隆了凡纳滨对虾的SOCS基因(Lv-SOCS,GenBank注册号:KJ000426),利用在线软件进行了生物信息学分析,运用半定量的方法进行了组织表达分析,并利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析了该基因在白斑杆状病毒(WSSV)侵染过程中的表达变化特征。结果显示,Lv-SOCS的ORF区1 191 bp,编码397个氨基酸,预测分析显示该基因编码的蛋白质含有1个SH2结构域和1个SOCS-box结构域,组织表达分析表明该基因主要在凡纳滨对虾血细胞、肠道和肝胰腺中表达。在WSSV感染后中晚期(6~48 hpi),Lv-SOCS可以被显著诱导,在血细胞中呈明显上调表达趋势,表明该基因在一定程度上参与了凡纳滨对虾体内由WSSV引发的先天免疫应答过程,上述结果为进一步研究Lv-SOCS基因在对虾应答病毒侵染过程中的功能和作用机制奠定了基础。     

鱼类金属硫蛋白基因的表达与调控

金属硫蛋白(Metallothionein,MT)是一类能选择性地结合重金属离子的低分子量蛋白质。自Marafante及其同事于1970年证明MT在真骨鱼类中的存在以来,人们就对MT在动物体内和体外的作用和功能进行了广泛的研究。Dunn等(1987)对鱼类MT的研究表明,这类蛋白质长度极为均一,由60~61个氨     

Gene Expression in Black Tiger Prawns Following Intramuscular Injection of β-gal Plasmid

Gene expression in black tiger prawns (Penaeus monodon) was studied following intra-muscular injection of CMVGal plasmid into the second abdominal segment. We used an in situ staining technique to detect -gal expression in one- and three-month-old injected prawns. We found that only one of the three-month-old prawns expressed the marker gene (2 days after injection), and the site of expression was confined to the sixth abdominal segment away from the injection site. We repeated the experiment on a new batch of three-month-old prawns, but using fluorometric determination technique. This time we found that -gal expression was detected (6/42) at the site of injection after 2, 7, and 14 days. In two other test samples, transgene expression was detected in the sixth abdominal segment only, further confirming the possibility of injected DNA dispersal. The results of the study also suggest that direct gene transfer is a feasible technique in black tiger prawns.     

鲤细胞因子多克隆抗体的制备及检测

为从蛋白质水平研究细胞因子在鲤体内免疫应答过程中的合成变化,本研究采用PCR技术克隆TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β基因含有部分抗原决定簇的片段,引入双酶切位点Bam HⅠ和HindⅢ后连接至p ET-32a/21a,构建相应的表达载体,制备多克隆抗体。采用ELISA检测抗体效价,并以此作为实验工具,检测经嗜水气单胞菌感染后鲤血清中炎性细胞因子的合成变化。结果显示,基因TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β融合蛋白分子量分别约为31.8、31.7、35.3、32.5、18.0和33.6 ku;抗体效价达到2.4×106;在病原菌感染后的不同阶段,促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和抗炎细胞因子IL-10、TGF-β呈现出不同的合成变化。研究表明,制备的抗体具有较高的效价、亲和力和特异性,可用于鲤细胞因子的定量研究,该抗体的获得为鲤免疫应答与细胞因子合成的系统研究奠定了基础。同时,获取的鲤细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β的抗体亦可用于其他鱼类细胞因子蛋白质水平的定量研究。     

中华绒螯蟹RXR基因全长cDNA克隆及表达分析

维甲类X受体(retinoid X receptor,RXR),属于核受体超家族(nuclear receptor super family)成员,是一种重要的调控因子,对甲壳动物生长发育和繁殖具有十分重要的作用。本研究根据陆地蟹 RXR基因保守区序列设计上下游引物,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)以及cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)RXR基因并进行各组织间的表达分析。序列分析表明中华绒螯蟹RXR cDNA全长1517bp,编码433个氨基酸。经BLASTn和BLASTx分析表明,中华绒螯蟹RXR氨基酸序列与陆地蟹RXR基因的氨基酸序列相似性最高,为96%。系统进化树分析显示,中华绒螯蟹RXR的氨基酸序列与陆地蟹RXR聚为一支。荧光定量PCR结果显示,RXR在所有检测的组织中均有表达,且在中华绒螯蟹Y器官中表达量最高,肝胰腺、鳃和肌肉中有少量表达,心脏、胃、肠、胸神经节和脑神经节中微量表达。在中华绒螯蟹不同蜕皮时期中,Y器官中RXR表达量在D期最高,与AB期、C期呈显著性差异（P＜0.05）;肌肉中RXR在AB期表达量最高,与其他蜕皮时期呈显著性差异（P＜0.05）;肝胰腺和鳃中RXR在AB期表达量最高,E期表达量最低,但各蜕皮时期表达量之间差异不显著。     

CYP2J3样基因在不同生长速率凡纳滨对虾中的差异表达

为了获得对虾生长差异的分子机制,通过比较不同生长速率凡纳滨对虾的转录组(速长组和慢长组),获得了一条编码P450的差异表达基因,经过cDNA全长验证后命名为LvCYP2J3-like,其开放阅读框为1 488 bp,编码495个aa,含有一个完整的P450功能域,功能分析表明,该基因可能参与了蜕皮激素的灭活。方差分析表明,LvCYP2J3-like在不同组织、发育阶段和蜕皮周期的表达量都存在显著性差异,并且速长群体的表达量显著性低于慢长群体。表明该基因参与了发育和蜕皮过程,其表达量与环境胁迫关系密切。在LvCYP2J3-like和其预测转录因子基因中分别发现了4和11个速长组和慢长组等位基因频率显著差异的单核苷酸多态性(SNP)标记,说明这些基因遗传差异与其活性和表达量相关,从而影响生长速率。研究结果为凡纳滨对虾遗传和育种研究提供了参考资料。     

MdMYB1转录因子调控红星苹果果实着色的计算机模拟分析及表达验证

 从‘红星’苹果(Malus domestica‘Delicious’) 果实中克隆获得了MdMYB1基因, 通过生物信息学分析( in silico analysis) 和活体细胞融合蛋白荧光观察, 确定其编码蛋白定位于细胞核。同时, 克隆了MdDFR和MdUFGT基因的启动子, 模拟分析表明2个基因的启动子序列中含有MYB结合的顺式作用元件。为了探讨MdMYB1转录因子是否调控MdDFR和MdUFGT基因的表达, 对不同光照条件下果皮花青素含量和基因表达进行了检测, 结果表明光照能够诱导花青素积累, 并迅速启动3个基因表达, 且3个基因表现出高度相似的表达模式, 表明MdMYB1转录因子可能直接调控MdDFR和MdUFGT基因的表达。