多房棘球绦虫-泡球蚴的体外培养研究

按照多房棘球绦虫幼虫-泡球蚴培养的培养基（RPMI-1640、M199和MEM）分为3组：Ⅰ组为含10％胎牛血清的RPMI-1640;Ⅱ组为含10％胎牛血清的MEM;HI组为含10％胎牛血清的M199。将泡球蚴在3种细胞培养液中进行培养,观察其存活、生长以及发育情况。结果显示,培养9d的泡球蚴的成活率分别为：Ⅰ组90．10％、Ⅱ组50．25％、Ⅲ组22．03％;成囊率分别为：Ⅰ组57．12％、Ⅱ组63．15％、Ⅲ组48．17％;头节外翻率分别为：Ⅰ组98．28％、Ⅱ组88．65％、Ⅲ组75．50％。可见,大多数虫体在早期向囊发育,一部分虫体头节外翻,并伴有规律的伸缩运动,但随时间的延长虫体运动减缓,又向囊蚴发育。通过对多房棘球绦虫泡球蚴的体外培养,初步表明合有10％小牛血清的细胞培养基RPMI-1640较适合泡球蚴的生长发育,为研究寄生虫发育提供了最基本的数据资料。     

犬细粒棘球绦虫粪抗原夹心ELISA检测方法的建立

为建立特异性和敏感性高的检验犬细粒棘球绦虫感染的方法。用细粒棘球绦虫(简称,Eg)成虫抗原分别免疫兔和绵羊,收集高免血清,纯化的高免抗体。依据抗体夹心ELISA工作原理,以兔抗体包被,检测感染Eg、不同犬带科绦虫的实验犬和空白犬粪样,绵羊抗体扑捉抗原,HRP标记兔抗绵羊IgG(1∶8 000)催化显色,用酶标仪测定OD 405nm吸光度,用以确定其特异性和敏感性。试验结果表明,敏感性为82.69%(43/52),特异性为85.88%(140/163);粪抗原在感染细粒棘球绦虫16d后可检出,最低抗原浓度为9.7ng/mL即犬感染5条成虫时可检测出阳性。该检测方法具有较好的特异性和灵敏性,为进一步研制检测细粒棘球绦虫虫体抗原ELISA检测试剂盒奠定了基础。     

细粒棘球蚴病的诊断与防治

对细粒棘球蚴病的诊断与防治进行了综述,以期为该病的进一步研究提供参考。     

细粒棘球蚴生发层细胞的分离及初期培养

绵羊源细粒棘球蚴生发展，经研磨法或０．２５％胰蛋白酶消化法处理，均可获得能在体外增殖的生发细胞。该细胞用ＲＰＭＩ１６４０完全培养基培养于胶原蛋白包被的培养板中，７２小时即开始增殖。     

Ultrasonographic screening for cystic echinococcosis in sheep in Tunisia

Sheep from the areas of Fondouk-Jeddid, Bir Mchergua and El Fahs, located in the Northeast of Tunisia, were examined by ultrasonography between 2001 and 2004 in order to assess their infection with Echinococcus granulosus, the agent of hydatid disease, and to evaluate this method as an efficient aire for hydatid cysts. A total of 1039 sheep, aged between 1 and 14 years was examined. The highest prevalence was found in sheep aged more than 8 years. The least infected animals were aged between 1 and 2 years. All hydatid cysts detected by ultrasound were located in the liver. In all age-groups, the dead cysts were more numerous than viable cysts. Eighteen positive sheep were autopsied and a comparison between ultrasound and autopsy results was performed. The results showed a prevalence of about 40% for the three areas. Ultrasonography allowed the cysts, deep or superficial to localize in the central or left part in relation to the caudal vena cava of the animals. Consequently, all the cysts were not detected with this technique. This work shows that ultrasonography confirms the importance of ovine hydatid cyst in Tunisia and that its use as a mass screening approach for cystic echinococcosis in sheep could be helpful for the monitoring of this disease in a hydatid control program without great stress for the animals.     

细粒棘球绦虫TSP8基因在其不同发育阶段的差异表达及生物信息学分析

为研究细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,E.g)TSP8基因的分子特性以及其在虫体不同发育阶段的差异表达,根据NCBI GenBank数据库中的TSP8基因设计1对特异性引物,对TSP8基因进行PCR扩增,将PCR产物克隆到pMD19-T载体后测序,通过生物信息学软件分析预测TSP8基因的结构与功能,并通过SYBR Green Ⅰ qRT-PCR方法分析TSP8基因在虫体原头蚴、包囊壁以及成虫mRNA相对转录情况。结果显示：成功克隆到细粒棘球绦虫TSP8基因序列,与细粒棘球绦虫跨膜蛋白(GenBank登录号：CDS17460.1)同源性为100%;进一步生物信息学分析显示,TSP8基因全长669个核苷酸,编码222个氨基酸,理论等电点为5.06,为稳定蛋白分子;TSP8基因编码的氨基酸序列共含有5个跨膜区域,含有4个优势B抗原表位;qRT-PCR结果显示TSP8基因在原头蚴及成虫阶段均有表达,差异显著,具有统计学意义(P<0.05)。本研究对细粒棘球绦虫TSP8基因的分子特性进行了初步研究,为进一步揭示其生物学功能奠定了基础。     

羊棘球蚴(包虫)间接ELISA抗体检测试剂盒的研制

[目的]研制基于Eg95重组蛋白为检测抗原的羊棘球蚴(包虫)间接ELISA抗体检测试剂盒。[方法]以细粒棘球蚴Eg95重组蛋白为检测抗原,筛选间接ELISA的最佳反应条件,确定ELISA的判定标准,检测敏感性和重复性,组成、包装试剂盒并初步应用。[结果]建立的ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,检测阳性血清和阴性血清的准确率均为100%。[结论]研制的羊棘球蚴(包虫)病ELISA抗体检测试剂盒可用于细粒棘球蚴Eg95亚单位疫苗抗体水平的检测。     

新疆塔城地区绵羊细粒棘球蚴流行株基因分型研究

为了探明新疆塔城地区绵羊细粒棘球蚴流行株基因型,根据GenBank公布的12S rRNA基因和CO1基因分别设计特异性引物,对58个绵羊细粒棘球蚴包囊进行PCR检测,再通过CO1特异性引物对检测阳性病料进行PCR扩增、测序及基因分型。通过12SrRNA基因检测发现58份样品均为阳性;对所测得的58条CO1基因序列分析,发现新疆塔城地区绵羊细粒棘球蚴流行株基因型均为G1型,且CO1基因序列存在多态性,为塔城地区绵羊细粒棘球蚴病的防控提供了科学依据。     

基于转录组测序分析细粒棘球绦虫原头蚴与巨噬细胞RAW264.7免疫互作相关基因

旨在解析细粒棘球绦虫原头蚴与巨噬细胞RAW264.7免疫互作相关的基因,为进一步阐明细粒棘球绦虫原头蚴调控宿主免疫反应及寄生适应机制提供理论依据。将细粒棘球绦虫原头蚴和巨噬细胞RAW264.7共培养24 h,收集原头蚴和RAW264.7细胞,提取总RNA,构建cDNA文库,利用RNA sequencing技术进行转录组测序分析。当细粒棘球绦虫原头蚴与巨噬细胞RAW264.7共培养24 h后,和0 h对照组相比,原头蚴处理组分别有435个基因的表达出现显著差异变化,其中,上调表达的基因为227个,包括HSP70、HSP10、Eg95前体分子、AgB、FABP和囊泡运输蛋白SC22B等;下调表达的基因为208个,包括EF-hand蛋白、Cathepsin、跨膜蛋白144、内固醇类受体和MAPK7等。GO分析结果表明,差异表达的基因主要富集在血红素转运、铁配位实体运输、细胞外间质、核糖核酸酶MRP复合物、丝氨酸型内肽酶抑制剂活性以及α-半乳糖苷酶活性等过程。KEGG分析结果表明,差异表达的基因主要参与剪接体、内吞作用、内质网的蛋白质处理、吞噬体、MAPK信号通路以及钙信号通路等。当巨噬细胞RAW264.7与细粒棘球绦虫原头蚴共培养24 h后,和PBS对照组相比,原头蚴处理组的RAW264.7细胞共有3 745个基因的表达出现显著变化,其中,1 159个基因出现上调表达,2 586个基因出现下调表达。GO分析结果显示,差异表达基因主要富集在代谢过程、细胞内组分、细胞内、细胞器以及膜结构细胞器等。KEGG信号通路的分析结果表明,差异表达的基因主要参与代谢通路、核糖体通路、剪接体通路、RNA转运以及泛素介导的蛋白水解等通路。同时研究随机选取了部分差异表达的基因进行了qRT-PCR验证,结果表明,其表达趋势与RNA-seq结果一致。综上所述,当细粒棘球绦虫原头蚴面对宿主巨噬细胞免疫压力时,可引起其基因的差异表达,其中,原头蚴中的AgB、FABP1和Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂等具有免疫调节作用的分子表达明显上调,推测其可能参与宿主的免疫调控,进而有利于虫体在宿主的寄生和免疫逃避。