Cloning, expression, and characterization of the MSP1a and MSP1b recombinant proteins from PR1 Anaplasma marginale strain, Brazil

The Anaplasma marginale is a bacterium that has obligate intraerythrocytic multiplication in cattle causing important economic loss. The A. marginale major surface protein 1 (MSP1) complex, heterodimer composed of MSP1a and MSP1b, has been identified as adhesins for bovine erythrocytes. The objectives of this study were to sequences the msp1β gene and produce and characterize recombinant MSP1a and MSP1b from a Brazilian strain of A. marginale, PR1. The msp1α and msp1β genes from the PR1 strain were cloned and expressed in E. coli BL21 Star using the vectors pET102 and pET101/D-TOPO. Antibodies were produced against the recombinant proteins and were shown to react with rMSP1a and rMSP1b demonstrating a molecular mass of 70 kDa to 105 kDa and 100 kDa, respectively for these proteins. Bovine erythrocytes were agglutinated by BL21/rMSP1a and BL21/rMSP1b and, this agglutination was inhibited by the presence of the IgY anti-rMSP1a, confirming the adhesion function of these proteins. Additionally, using the IgY anti-rMSP1a and rMSP1b in a IFI, the presence of rMSP1a and rMSP1b was confirmed on the outer membrane of the recombinant E. coli BL21. Our results show that the msp1β gene from the PR1 strain has both the conserved region and contain the defined polymorphism regions previously described for other strains of A. marginale. The results from this study confirm adhesive functions for rMSP1a and rMSP1b from PR1 strain in bovine erythrocytes invasion.     

传染性支气管炎病毒青岛腺胃分离株(SD/97/02)基质蛋白、5a、5b 蛋白基因的克隆和序列分析

参考 Gen Bank上的传染性支气管炎病毒 (IBV)序列 ,自行设计合成了 3条引物 ,对 IBV青岛腺胃分离株 (SD/97/ 0 2 ) RNA进行 RT- PCR扩增 ,扩增含基质蛋白 (M)及 5 a、5 b蛋白基因的约 1.6 5 kb的片段 ,对 PCR产物进行克隆后测序。序列分析显示 ,M蛋白基因与其他 IBV相应的基因同源性在 90 .33%～ 92 .75 %之间 ,氨基酸序列比较 ,同源性在 89.82 %～ 94.2 5 %之间 ;5 a基因与其他 IBV的基因同源性在 84.34 %～ 87.37%之间 ,氨基酸同源性在 81%～82 %;5 b基因与其他 IBV的基因同源性在 91%～ 92 %之间 ,氨基酸同源性在 93%左右。     

鸡痘病毒基因探针检测方法的建立及初步应用

利用PCR方法成功克隆了鸡痘病毒（Fowl poxvirus，FPV）4b核心蛋白基因549bp片段，序列分析表明，该序列与模板DNA（AF198100）碱基序列的同源性为99．45％，只有3个碱基差异，第215位由C→T，第386位由T→A，第388位由G→A。回收FPV4b核心蛋白基因549bp片段，以其为模板制备了地高辛标记的DNA探针。对新标记的探针进行标记效率检测，结果显示其标记效率为100mg／L；敏感性检测表明，该探针对同源DNA的检出限量为10Pg；特异性检测结果表明，用本试验所标记的探针对提取的FPV282E4和FPV儿株DNA、重组质粒pMD 18-T-4b进行检测结果均呈阳性，而鸡马立克氏病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、CEF的核酸提取物均成阴性，说明该探针具有较强的特异性。初步应用表明，本试验所建立的FPV的基因探针检测法可用于FPV的检测。     

核桃举肢蛾线粒体CO I和Cytb基因片段序列分析

核桃举肢蛾（Atrijuglans hetaohei）是危害核桃果实的主要害虫,严重影响核桃的产量和商品价值。在最新的形态学分类上,核桃举肢蛾属于鳞翅目、麦蛾总科、黑展足蛾属。通过同源序列比对探讨利用DNA条形码技术（DNA barcoding）对核桃举肢蛾进行分类鉴定的准确性。运用2对通用引物分别扩增核桃举肢蛾线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（CO I）基因和细胞色素b（Cytb）基因片段,并与鳞翅目麦蛾总科、巢蛾总科、凤蝶总科、螟蛾总科等昆虫的同源片段进行碱基组成多样性和系统进化分析,扩增得到核桃举肢蛾CO I基因664 bp片段和Cytb基因479 bp片段。结果表明:核桃举肢蛾线粒体CO I基因片段中,A、T、G和C 4种核苷酸的含量分别为29.5%、39.4%、15.1%和16.1%,A+T的含量(68.9%)明显高于G+C含量（31.1%）,存在显著的AT使用倾向性。在Cytb基因片段中, A、T、G和C 4种核苷酸的含量分别为33.4%、41.5%、10.2%和14.8%,A+T的含量为74.9%,也明显高于G+C含量（26%）。两段序列都以T-A间颠换和T-C间转换为主要替换方式,且密码子第2位点保守性最强,第3位点变异率最高。基于CO I和Cytb基因片段构建的NJ系统进化树均显示核桃举肢蛾与麦蛾总科昆虫处于同一个分支之下。利用DNA条形码技术得到的核桃举肢蛾分子生物学分类结果与传统的形态学分类结果一致。     

乌骨绵羊NR5A2基因编码区序列克隆及特征分析

为了研究NR5A2基因在乌骨绵羊中的序列特征,利用PCR和克隆测序技术获得乌骨绵羊NR5A2基因的外显子序列,用DNAMAN软件和DNAStar软件对序列进行比对和拼接、运用Clustal软件与其他物种相应序列进行同源比对分析,MEGA5.1软件用来构建哺乳动物NR5A2蛋白质系统进化树,用DNA池方法对其编码区序列的SNPs位点进行筛选。结果显示:乌骨绵羊NR5A2基因编码区全长1 488 bp,共编码495个氨基酸;乌骨绵羊的NR5A2基因编码区核苷酸序列与湖羊和牛的同源性分别为99.87%和85.51%;氨基酸序列的一致性分别为99.41%和89.66%。与湖羊相比,乌骨绵羊NR5A2基因编码区共发现3个单碱基突变(C1069A、C1419T和G1485A),其中C1069A位点突变引起了氨基酸的改变,从亮氨酸变为异亮氨酸。在乌骨绵羊的编码区现了一个单核苷酸突变位点G999C。     

巨(魾)细胞色素氧化酶基因多态性及系统进化研究

采用PCR技术克隆得到12尾巨(魾)(Bagarius yarrelli)的细胞色素氧化酶Ⅰ(COⅠ)、细胞色素氧化酶Ⅱ(COⅡ)和细胞色素氧化酶Ⅲ(COⅢ)的基因序列.结果显示:巨(魾)CO Ⅰ基因序列全长1 551 bp,12个个体共出现9个单倍型,13个突变位点;COⅡ基因序列全长691 bp,12个个体共出现5个单倍型,5个突变位点;COⅢ基因序列全长784 bp,12个个体出现7个单倍型,8个突变位点.通过最小进化法Minimum Evolution (ME)构建系统发育树分析显示,巨(魾)与14种鱿科鱼在序列上有一定的同源性,并且CO Ⅰ、COⅡ和COⅢ都与中华纹胸姚(Glyptothorax sinense)、福建纹胸鱿(Glyptothorax fukiensis)、三线纹胸鱿(Glyptothorax trilineatus)和长丝黑鱿(Gagata dolichonema)在同一个分支,表明巨(魾)与纹胸鱿属和黑跳属有较近的亲缘关系.     

黑龙江流域黑斑狗鱼遗传多样性的Cytb基因初探

[目的]了解黑龙江流域黑宽狗鱼不同地理群体的遗传多样性,为其种质资源的保护和开发提供分子的依据。[方法]从4尾来自黑龙江、17尾来自乌苏里江和5尾来自牡丹江的黑斑狗鱼中提取DNA,测定其线粒体DNA细胞色素b基因序列,采用Kirmra2-parameter模型计算各群体间和单倍型间的遗传距离;以白斑狗鱼为外类群,用邻接法构建系统发育树,构建单倍型的简约性网络图;根据单倍型多样性和核苷酸多态性等信息评估种群的遗传多样性。[结果]获得黑斑狗鱼细胞色素b（Cytb）基因1053bp序列,其中G含量最低,仅14．2％,A＋T含量（57．7％）高于G＋C含量（42．3％）;变异位点有8个,总变异率为0．76％,其中简约信息住点有3个;序列中无插入和缺失,转射颠换为7／1,26尾黑癍狗鱼中共有7个单倍型,单倍型多样性（H）较高（0．76308±0．00315）,但核苷酸多态性（π）极低（0．00126）;3个地理群体黑斑狗鱼群体间遗传距离小（0．067％～0．143％）。[结论]黑龙江流域3个群体的26尾黑斑狗鱼属于同一个种群,其遗传多样性极为贫乏,种质资源亟需得到有效保护。     

CRISPR/Cas13b系统对猪流行性腹泻病毒增殖的抑制作用

【目的】猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种对养猪业造成巨大损失的高致死率的传染性疫病。CRISPR/Cas13b系统精准切割和编辑RNA的功能提供了一种靶向抑制RNA病毒的策略。本研究尝试利用CRISPR/Cas13b的RNA干扰功能对PEDV的基因组RNA进行切割,以探索一种新型的PEDV病毒抑制策略。【方法】设计了4对靶向PEDV基因组不同区域的CRISPR RNA(crRNA)位点,构建了CRISPR/Cas13b打靶载体,以打靶载体转染Vero细胞,并利用PEDV感染转染细胞,检测PEDV在CRISPR/Cas13b转染细胞内的增殖情况。【结果】CRISPR/Cas13b系统对PEDV在Vero细胞的增殖具有明显的抑制作用。打靶载体U6-crRNA3和U6-crRNA4转染组相较于正常细胞组,病毒免疫荧光试验中荧光团明显减少;定量PCR结果显示,打靶载体转染组在细胞水平抑制50%以上病毒增殖量。【结论】本研究构建的CRISPR/Cas13b系统能有效抑制PEDV增殖,为开发有效的RNA病毒防控手段、建立抗病动物模型提供了新的研究策略。     

花鲈性腺分化组织学及性别相关基因cyp11b和cyp19a1a的表达分析

以花鲈(Lateolabrax maculatus) 1~214 dph (day post hatching)的仔稚鱼、幼鱼以及18月龄的雌鱼和雄鱼为研究对象,研究了花鲈早期性腺发生、发育和分化情况;分析了性腺分化过程中性别相关基因(cyp11b和cyp19a1a)的表达及与性别之间的关系。结果显示,在30 dph [全长为(1.28± 0.10) cm],首次在中肾管前端的腹腔膜周围观察到原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs),说明30 dph前是花鲈胚后PGCs迁移至生殖嵴的关键时期;在55 dph [全长为(2.45±0.19) cm],观察到一对呈对称分布的原始性腺已经形成,说明花鲈幼鱼的原始性腺在30~55 dph (全长为1.28~2.45 cm)之间发生;55~180 dph时(全长为2.45~12.28 cm),原始性腺不断发育变大,并且一直处于未分化状态;180 dph后性腺开始分化;在195 dph [全长(14.54±1.54) cm]观察到精巢开始分化,卵巢于205 dph [全长为(15.86±0.94) cm]开始分化,且性腺的解剖学分化要早于细胞学分化;18月龄的花鲈幼鱼性腺发育到Ⅱ期。性别分化相关基因cyp19a1a在花鲈卵巢中的表达量高于同期精巢,说明其在卵巢的分化及维持中发挥更关键的作用,而cyp11b在18月龄幼鱼Ⅱ期精巢中的表达量显著高于同时期的卵巢及Ⅰ期精巢,说明其主要在精巢的分化及维持中扮演重要角色。本研究结果不仅可以丰富花鲈的繁殖生理学资料,也为其性别调控技术的研究提供了科学依据。     

二倍体泥鳅线粒体细胞色素b基因的序列分析

对二倍体泥鳅的线粒体细胞色素b基因进行PCR扩增和正反测序,在5个个体中均得到序列一致的细胞色素b基因片断,长度为1140bp,A、T、G、C含量分别为313（28％）、358（31％）、170（15％）、300（26％）,A＋T〉C＋G,与其他水生动物相同基因片段碱基序列含量相似,该基因中密码子第1位核苷酸中4种碱基组成较为均衡;第2位核苷酸中T的使用率较高,为33．4％,G的使用率较低,为17．1％;密码子第3位A的使用率高,为34．2％,而G的使用率较低,仅为7．9％;由泥鳅细胞色素b基因片断推导出对应的氨基酸序列,在氨基酸序列中Leu占11．％,远高于其他氨基酸。