一步法 RT-LAMP-HNB 检测兰花建兰花叶病毒和齿舌兰环斑病毒方法的建立

【目的】全世界兰花病毒有 50 余种，建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）和齿舌兰 环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus, ORSV）是其中最常见的两种病毒。目前仍没有有效的措施能够控制病毒 病，因此建立针对病毒的高效监测、检测方法，对控制兰花病毒感染具有至关重要的意义。【方法】以兰花病 毒 CymMV 和 ORSV 为试验材料，采用反转录 - 环介导等温扩增方法（RT-LAMP）进行病毒 RNA 的扩增，从而 建立 CymMV 和 ORSV 的快速检测方法。分别根据两种病毒的 cp 基因序列保守区设计 RT-LAMP 引物，在一步 法 RT-LAMP 反应体系中加入羟基萘酚蓝（HNB，终浓度 200 µmol/L）作为扩增产物指示剂，不需开盖进行凝胶 电泳检测，便可直接根据体系颜色变化判读反应结果。【结果】利用该检测方法能够在 2 h 测出样品中是否存在 CymMV 和 ORSV 病毒 RNA，其灵敏度是 RT-PCR 的 10 倍。对 20 株田间样品进行一步法 RT-LAMP-HNB 检测， 根据田间检测结果显示，CymMV 检出率为 70%，ORSV 检出率为 55%，与 RT-PCR 结果保持一致，该法适用于 田间样品检测。【结论】建立的一步法 RT-LAMP-HNB 是一种灵敏、快速、特异、便捷的 CymMV 和 ORSV 检 测方法，仅需要简单控温设备如水浴锅便可进行核酸扩增，适用于在基层或不便利地区推广使用。     

建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)的脱除研究

本研究的主要目的是通过茎尖培养的技术手段来探索蝴蝶兰病毒的脱除问题,为建立工厂化无毒苗培养体系提供技术支撑。长期的工厂化生产,使蝴蝶兰经常感染各种病毒,导致叶片产生枯斑、褪绿、坏死等现象,使花朵畸形变色。其中建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)是最常见的2种病毒。实验取已检测出含有CymMV和ORSV病毒的蝴蝶兰植株花梗,进行诱导丛生芽的培养,对丛生芽进行继代增殖形成组培苗用于脱毒处理。切取组培苗的茎尖顶端分生组织进行培养,茎尖长度在1~6 mm之间,随着茎尖长度的增加,成活率上升,脱毒率明显降低。取2~3 mm组培苗茎尖,经0、10、20、30、40 mg/L的三氮唑核苷浸泡15 min处理和在含有相应浓度的三氮唑核苷培养基中培养30天后,继代培养形成再生植株。实验采用ELISA法对脱毒前的蝴蝶兰植株以及脱毒后的再生植株进行2种病毒检测,通过显色反应判断是否含有病毒病原。实验结果表明,蝴蝶兰脱毒苗的成活率随着三氮唑核苷浓度的增加而降低,当其浓度达到40 mg/L时,茎尖顶端分生组织出现严重的透明和褐变现象,未获得再生植株。而试管再生苗的脱毒率则随着三氮唑核苷浓度的升高而增加。在添加30 mg/L的三氮唑核苷进行化学抑制病毒的处理后,可以比单纯使用茎尖培养的方式脱毒率提高22.3%。     

墨兰根状茎绿芽分化的研究

对影响墨兰根状茎绿芽分化的几个因素进行研究的结果表明:在基本培养基中添加5.00 mg·L-1 6-BA+0.50 mg·L-1 NAA的激素配比,绿芽产率高达180%,且绿芽生长势旺盛.低剂量(1和2 Gy )60Coγ-射线辐射可促进根状茎绿芽分化,提高绿芽产率和生长势;高剂量(5～10 Gy )辐射则显著降低绿芽产率,使其生长势减弱.活性炭完全抑制绿芽分化,促进了脱分化状态下的根状茎增殖生长.     

墨兰杂交及F1代离体培养研究

以墨兰为研究对象,通过人工授粉,检测墨兰与春兰杂交后的坐果率和种子的离体萌发率;种子萌发后形成根状茎,筛选适宜根状茎增殖分化的培养基.结果表明:墨兰为母本的座果率为100%;果龄200~220 d采收适宜于离体播种;离体种子萌发后形成根状茎,其适宜的根状茎增殖分化培养基为1/2MS+6-BA2.0 mg·L-1+KT0.5 mg·L-1+NAA0.05 mg·L-1.     

墨兰 CsAP1-A 基因克隆及表达分析

【目的】AP1 基因在植物的花器官发育和开花调控中发挥重要作用，对墨兰 AP1 基因进行克隆与表达分析可为研究其在墨兰花发育和开花调控中的作用提供前期基础。【方法】以墨兰品种‘小香’为材料，克隆到 1 个 AP1 基因，命名为 CsAP1-A。通过生物信息学分析其基因结构、蛋白结构域和进化关系，利用 RT-qPCR 方法分别检测 CsAP1-A 在墨兰不同器官、不同花发育阶段和不同花组织部位的表达情况；通过转录组测序分析 CsAP1-A 在 5 个不同花型墨兰品种花组织部位的表达情况；通过蛋白互作预测软件分析 CsAP1-A 与其他蛋白的互作关系。【结果】CsAP1-A 基因编码区为 744 bp，编码 248 个氨基酸，含有高度保守的 MADS-box 和K-box 结构域，符合 MADS-box 转录因子家族特征。CsAP1-A 与其他兰科植物 AP1 蛋白相似性较高，其中与春兰 AP1/FUL3（APY18447.1）和蕙兰 MADS1（AGE15496.1）的同源性最高。RT-qPCR 分析结果表明，CsAP1-A在墨兰不同器官中均有表达，在花中表达量最高，且集中在花芽分化初期（S1）高表达。在不同花型的墨兰品种中，CsAP1-A 在 WT（普通型）、MPV（重瓣花型）、LaPV（花瓣唇瓣化花型）和 NLV（唇瓣萼片化花型）4 种花型的合蕊柱中表达量均最高，而在萼片中表达量最低；在合蕊柱异常发育的 MPV 中，CsAP1-A 在合蕊柱的表达量显著提高，而在花瓣蕊柱化的梅瓣花型（GPV）中整体表达量最高，且表达区域从合蕊柱扩展到花瓣。蛋白互作预测 CsAP1-A 蛋白可与 MADS1、MADS6、MADS47、MADS8 等 10 个蛋白存在互作关系。【结论】墨兰 CsAP1-A 的基因结构、进化关系、时空表达情况和蛋白互作预测可为墨兰花发育的研究提供理论依据，对进一步揭示 CsAP1-A 基因在墨兰成花过程中的作用奠定基础。