猪瘟病毒E2基因主要抗原区的克隆及其原核表达

为研究猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位在机体免疫应答中的作用和特点,试验参照猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)的基因组序列,设计、合成了1对引物,应用RT-PCR方法扩增出长为786 bp的基因片段,命名为zE2,将zE2基因克隆到原核表达质粒pET 32a中,经酶切鉴定后转化大肠杆菌Rosetta(DE3),于37℃、1.0 mmol/L IPTG条件下诱导表达,大肠杆菌菌体裂解产物再经SDS-PAGE和Western-blot分析。结果表明:该基因片段得到较高表达,融合蛋白的分子质量约为48 ku,主要以包涵体形式存在,且具有一定的免疫学活性。     

猪瘟病毒E2蛋白研究进展

猪瘟（Classical Swine Fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus,CSFV）引起的一种急性、接触性传染病。目前该病流行于除北美洲和大洋洲以外的其他大洲和地区,呈世界性分布,在一些原已宣布消灭猪瘟的欧洲国家（荷兰、比利时、英国、德国、意大利、西班牙等）又相继复发。虽然我国长期坚持全面接种猪瘟兔化弱毒疫苗,但目前猪瘟在我国依然存在,流行特点从以往的频发大面积流行转变为无规律区域性的散发,隐性持续性感染病例增多,因此应明确猪瘟病毒的基因组结构和最具免疫防制研究价值的抗原蛋白结构,为研制新型有效的疫苗和诊断试剂提供理论依据。本文就猪瘟病毒的基因组结构、猪瘟病毒E2蛋白的结构、功能、所包含的抗原表位以及E2蛋白的表达应用等方面的研究进展作以综述。     

猪外周血单个核细胞cDNA酵母表达文库的构建及与猪瘟病毒E2蛋白相互作用细胞蛋白的筛选

为研究猪瘟病-毒(CSFV)蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用,本研究通过SMART技术合成猪外周血单个核细胞(PBMC)双链cDNA,以携带与载体pGADT7-Rec重组位点同源序列的特异引物经long-distance PCR扩增双链cDNA.纯化双链cDNA并与载体pGADT7-Rec共转化酵母菌株Y187,经同源重组构建PBMC cDNA酵母表达文库.以CSFV E2蛋白为诱饵进行酵母双杂交筛选,得到阳性克隆根据序列比对分析结果,进一步进行共转化验证.结果显示筛选到17个与CSFV E2蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,基因注释(GO)分析表明这些蛋白分别参与免疫、代谢、细胞生长与增殖、生物调节等过程,为研究它们与CSFV E2的相互作用奠定了基础.     

2007-2010年江苏地区猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测及部分Nsp2基因序列分析

本研究参考GenBank已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）Nsp2基因序列,在高致病性病毒Nsp2基因缺失区的两端保守区设计并合成了一对引物,建立并优化了能够区分经典PRRSV和高致病性PRRSV的RT-PCR诊断方法,并利用该方法对2007～2010年间江苏地区的45份可疑临床病料进行了检测。结果表明临床病料阳性率为40％,所有毒株均属于高致病性毒株。对PRRSV阳性病毒的Nsp2基因序列分析表明,所有18株PRRSV均属于美洲型毒株,与中国高致病性PRRSV代表毒株JXA1、WUH1的氨基酸同源性分别在82．2％～97．6％、80．4％～95.3％。此外,18株病毒的Nsp2共同存在不连续的30个氨基酸缺失,缺失位置与同期中国高致病性PRRSV具有相同的特征。通过本研究掌握了江苏地区2007～2010年间PRRSV流行情况及Nsp2基因变异特征,为地方猪繁殖与呼吸综合征的临床诊断和防治提供参考依据。     

猪H3N2亚型流感病毒受体亲和性鉴定

利用固相酶联方法对分离自吉林省猪群中的3株H3N2亚型流感病毒进行了受体亲和性鉴定.结果显示,这3株病毒与SAα2,3和SAα2,6受体都能结合,并且偏嗜SAα2,6受体,暗示它们具有感染人的潜能.因此应该加强猪流感的流行病学调查,及时发现那些具有引发人流感流行潜能的病毒,为防控人间流感提前做好准备.     

带有GFP的小鼠Sox2基因逆转录病毒载体的构建及其检测

为了建立体细胞重编程过程中检测Sox2基因表达变化的方法,本研究利用克隆获得的小鼠Sox2基因与逆转录病毒载体pMX—IRES—GFP连接,构建带有报告基因GFP的逆转录病毒载体,将其转染293GP细胞后获得假病毒上清。将获得假病毒上清侵染小鼠成纤维细胞（NIH3T3细胞）后观察GFP的表达和检测Sox2转录量的变化。其结果,成功构建带有GFP的Sox2基因逆转录病毒载体pMX—Sox2-IRES—GFP;将构建的载体转染后293细胞后获得能侵染NIH3T3细胞的假病毒上清,且与未侵染的NIH3T3细胞相比,侵染后的NIH3T3细胞的Sox2表达量提高近10倍。本研究为开展在体细胞重编程过程中Sox2表达与重编程效率的相关性提供依据．     

新孢子虫dNcSRS2重组蛋白间接ELISA的建立及其应用

利用新孢子虫体外重组表面蛋白dNcSRS2蛋白作为包被抗原，对各项条件进行优化，确定判定标准，建立了检测新孢子虫血清抗体的间接ELISA方法。经对多例血清检测表明，所建立的诊断试剂盒重复性好、特异性强、灵敏度高，与进口的IFAT及两种商品化ELISA试剂盒的检测结果相比较，符合率均达到92％以上。应用建立的ELISA方法对236份奶牛血清的新孢子虫抗体进行检测，阳性率为22％。这是国内首次利用重组蛋白建立的诊断试剂盒，该方法的建立将为牛新孢子虫病的诊断与流行病学调查提供有效的技术手段。     

2011年-2013年滨州及其周边地区4种猪病毒性疾病的流行情况分析

通过对滨州及其周边地区2011年-2013年316个场次采集病料进行猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒与猪圆环病毒2型的检测,并对检测结果进行了统计分析,了解滨州及其周边地区上述4种疫病的流行状况。     

血清2型猪链球菌河南分离株毒力基因的鉴定及其cps2j全基因序列分析

为了解血清2型猪链球菌(S.suis2)河南分离株的毒力基因型及cps2j全基因突变情况,本研究扩增S.suis2毒力基因gdh、cps2j、mrp、ef 、sly、orf2和fbps,并对s.suis2的cps2j进行全基因序列测定和同源性分析.结果表明,gdh、cps2j、mrp、ef、sly、orf2和fbps基因在8个S.suis2分离株中的检出率分别为100％(8/8)、100％(8/8)、62.5％(5/8)、75％(6/8)、87.5％(7/8)、100％(8/8)和100％(8/8);其中cps2j全基因核苷酸及推导的氨基酸序列与来源不同的S.suis2分离株同源性分别达98％和97％以上,以该基因构建的系统发育树表明8株S.suis2河南分离株与国内外不同参考株同源性高,亲缘关系密切.     

黄嘌呤氧化酶传感器的研制及其对鱼鲜度的检测

将黄嘌呤氧化酶以共价连接法固定于二醋酸纤维素薄膜上，制成的酶膜与极谱式氧电极共同组成对次黄嘌呤进行定量测定的黄嘌呤氧化酶传感器。该传感器测定范围为１０～１２０ｍｇ／Ｌ，响应时间１０ｓ，不同浓度次黄嘌呤标准溶液对传感器１０ｓ响应值的相关系数为γ＝－０．９９６６，次黄嘌呤标准溶液重复测定６０次（１０ｓ响应值）的变异系数为ＣＶ＝０．３０３％。应用该传感器与分光光度法对鱼体次黄嘌呤含量进行了测定比较，二者具有良好的相关性。