联合肌注猪IL2真核质粒对PPV VP2-PCV2 ORF2核酸疫苗免疫效果的影响

将猪IL2基因和PPV VP2基因、PCV2 ORF2截短基因克隆至真核表达载体pCI-neo,构建了重组质粒pCI-ORF2-VP2和pCI-IL2,用脂质体介导法将pCI-ORF2-VP2质粒转染PK15细胞,采用间接免疫荧光法检测在体外的表达情况。并以小鼠为动物模型,将pCI-IL2和pCI-ORF2-VP2质粒联合肌注免疫小鼠,相同剂量免疫2次,间隔2周,同时设立pCI-ORF2-VP2、pCI空载体、猪细小灭活苗、圆环亚单位苗对照,检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞的转化功能,外周血T淋巴细胞亚群的动态变化及血清抗体的滴度。结果显示,pCI-ORF2-VP2在PK15细胞中能正常表达,联合免疫组在第28天能够检测到PPV和PCV2抗体,第21~42天诱导淋巴细胞转化和CD4+、CD8+细胞的数量高于或显著高于pCI-ORF2-VP2质粒组。结果表明,猪IL2质粒联合肌注可以提高VP2/ORF2核酸疫苗的免疫效果。     

PrP106—126诱导小胶质细胞BV-2抗氧化性能的变化

小胶质细胞活化是朊病的病理学特征之一。朊蛋白多肽PrP106—126具神经毒性,是研究异常腕蛋白（PrPSc）的理想工具。为探讨PrP106—126对小胶质细胞氧化压力的影响。本研究以小胶质细胞BV-2为细胞模型,PrP106—126作用48h,应用MTT和流式细胞仪检测细胞的活化情况,应用分子探针技术对细胞的氧化压力（reactiveoxygenspecies,ROs）进行检测,并通过荧光定量RT—PCR对与R0s相关的酶的mRNA表达进行了测定。结果表明PrPl06—126显著促进小胶质细胞BV-2的活化,并提高胞内的ROS水平;定量RT—PCR显示,PrP106—126显著降低细胞S0D-1（P〈0．01）表达水平、提高胞内Cat（P〈0．01）的表达水平;对Grx、Trx-1、和Trx-2mRNA的表达水平有升高的趋势,但未达到显著水平（P〉0．05）,对SOd-2、GPx、GR无显著性影响（P〉0．05）。从分子水平初步阐明小胶质细胞ROS升高的机理。     

家蚕葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶家族基因BmGMCβ2的克隆及序列与表达分析

葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶(glucose-methanol-choline oxidoreductases,GMC)家族是昆虫体内一大类以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶的氧化还原酶类,家蚕基因组中含有43个GMC家族基因。以家蚕5龄幼虫cDNA为模板克隆到一个家蚕GMC家族基因,命名为BmGMCβ2(GenBank登录号:JQ965926)。该基因cDNA全长1 875 bp,编码624个氨基酸,预测蛋白质分子质量为69.3 kD,pI为6.21,定位于家蚕16号染色体的nscaf3058上,编码蛋白质含GMC家族共有的ADP-bindingβ-α-β折叠结构域。系统发育分析表明该基因是家蚕GMC家族β亚家族基因成员。RT-PCR检测家蚕不同发育时期和5龄第3天幼虫不同组织中BmGMCβ2基因mRNA转录水平,以5龄盛食期最高,并且主要在表皮、脂肪体和气管中转录表达;Westernblotting分析BmGMCβ2蛋白主要在5龄第3天幼虫的脂肪体中表达。将BmGMCβ2克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,转化E.coli BL21表达菌株,IPTG诱导表达BmGMCβ2融合蛋白,通过His-亲和层析得到纯化的融合蛋白并制备多克隆抗体,为后续研究该蛋白在家蚕生长发育过程中的功能奠定了基础。     

两广地区2011--2012年H9N2亚型禽流感病毒的HA基因进化分析

为探究两广地区H9N2亚型禽流感病毒（avianinfluenzavirus,AIV）的变异情况及分子流行规律,于2011-2012年从该地区发病鸡群中共分离到16株H9N2亚型A1V,并对分离株HA基因进行测序与进化分析。结果表明,分离株HA基因开放阅读框全长均为1683bp,编码560个氨基酸;HA基因核苷酸同源性为88．7％～99．6％,编码氨基酸同源性为91．8％～99．5％。本试验分离毒株与国内疫苗株（GD-SS、SH—F和SD-6）的核苷酸同源性在90．1％～92．6％之间,推导的氨基酸序列同源性在91．6％～94．8％之间。进化分析显示分离株可分为Group1和Group2两个亚分支,与疫苗株均属于欧亚谱系的Y280分支,但亲缘关系较远。分离株HA蛋白裂解位点附近序列有3种形式：PARSSR＋GLF、PSRSSR＋GLF和PARLSR0GLF,均无连续碱性氨基酸的插A,符合低致病性AIv的特征。本试验发现分离株GD4、GX2在HA1的127、295位分别增加一个潜在的糖基化位点;除分离株GD5和GD6外,其余分离株在HAl的216位发生Q216L氨基酸突变,表明其存在感染人的可能性。     

Estimating “autotrophic” belowground respiration in spruce and beech forests: decreases following girdling

Seasonal fluxes of CO₂ from soil and the contribution of autotrophic (root + mycorrhizal) to total soil respiration (SR) were estimated for a mixed stand of European beech (Fagus sylvatica) and Norway spruce (Picea abies) in Central Europe. Mature trees of each species were girdled in August 2002 to eliminate carbohydrate allocation to roots. SR was measured at distances of 0.5, 1.0, and 1.5/2.0 m from the bole of each tree at 1–2 weeks intervals throughout the fall of 2002 and monthly during the spring and summer of 2003. The contribution of roots and mycorrhizae to total SR was estimated by the decrease in SR compared to ungirdled control trees to account for seasonal patterns evident in controls. SR decreased with soil temperature in the fall 2002 and increased again in 2003 as soil warmed. During most of the study period, SR was strongly related to soil temperature. During the dry summer of 2003, however, SR appeared to be uncoupled from temperature and was strongly related to soil water content (SWC). Mean rates of SR in beech and spruce control plots as well as root densities did not show a clear pattern with distance from the bole. SR decreased to levels below controls in beech within a few days after girdling, whereas spruce did not show a significant decrease until October 2002, 6 weeks after girdling. In both beech and spruce, decreased SR in response to girdling was greatest closest to the bole, possibly reflecting increased mycorrhizal activity close to the bole. Autotrophic respiration was estimated in beech to be as much as 50% of the total SR in the stand. The contribution of autotrophic respiration was less certain for spruce, although close to the bole, the autotrophic fraction may contribute to total SR as much as in beech. The large fraction of autotrophic respiration in total SR requires better understanding of tree level stresses that affect carbon allocation below ground.     

青花菜BoBURP2基因的克隆与表达分析

BURP是植物特有蛋白,在生长发育和抗逆反应中起着重要作用。本研究以青花菜为材料,利用PCR克隆到1个BURP基因,命名为BoBURP2。测序结果表明,BoBURP2的基因组DNA全长为1 218bp,具1个内含子,编码区全长为840bp,编码279个氨基酸;序列比对结果表明,该基因与BURP家族成员RD22具有较高的同源性。系统发育分析结果表明,BoBURP2与甘蓝、芜菁和甘蓝型油菜的同源序列相似性最高,在发育树上聚为一组,与醉蝶花的相似性最低,亲缘关系最远。RT-PCR结果表明,BoBURP2的表达受NaCl和干旱胁迫的诱导,表达量分别在24h和48h时达到最大值,暗示该基因与这2种逆境响应相关。青花菜BoBURP2的克隆与表达分析,为后续基因功能的鉴定和抗逆分子育种奠定了基础。     

猪瘟病毒E2蛋白在酵母中分泌表达条件的优化

影响外源基因在毕赤酵母中表达的因素很多，除了基因序列本身的内在特性外，表达条件对外源基因的表达量的高低也有着极显著的影响。本文对猪瘟病毒E2基因在毕赤酵母中不同的时间、不同的诱导型、不同的pH、不同的诱导剂量等方面表达量的差异进行了详细对比研究。结果表明，诱导后72～96h，重组E2蛋白的表达量最高。与单纯甲醇诱导相比，甘油／甲醇诱导后的表达量明显提高。在pH7．5和pH8．0表达E2蛋白是比较合适的。甲醇浓度在3％左右时E2蛋白的表达量较高。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型基因重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的构建

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7和猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1的核苷酸序列设计特异性引物,经RT-PCR/PCR扩增,分别扩增出大小为308 bp和417 bp的部分基因片段。用T4连接酶将目的片段与pGEM-Teasy载体系统连接,并转化到大肠杆菌DH-5α株感受态细胞。提取的质粒经PCR、酶切和测序鉴定,证实为PRRSV和PCV2的阳性重组质粒。将重组标准质粒10倍系列稀释后作为模板,通过实时荧光定量PCR方法(Real-time PCR),建立了PRRSV、PCV2的标准曲线及其直线回归方程,并确定其最佳读板温度。该方法具有线性关系好、特异性强、敏感性高、重复性好等特点,为分析PRRSV和PCV2共感染猪体内病毒的绝对含量提供了必要的技术平台。     

不同水分条件下小麦旗叶叶绿素a荧光参数与子粒灌浆速率

利用OS－30型叶绿素荧光分析仪研究水分胁迫对小麦旗叶叶绿素a荧光动力学参数的影响。结果表明，水分胁迫下旗叶的T1／2值减少，旗叶光系统Ⅱ（PSⅡ）原初光能转化效率（Fv/Fm)和潜在活性（Fv/Fo)降低，光合作用的潜在活力降低，这些参数下降影响了光合电子的传递和CO2同化的正常进行，表现在可变荧光淬灭速率减慢，可变荧光下降比值减小。同时还讨论了水分胁迫对灌浆速率的影响。     

作物-土壤氮循环对大气CO2浓度和温度升高响应的研究进展

在地球化学元素循环中,氮素是最重要、最活跃的营养元素之一。农田生态系统中的氮素很大程度上决定农作物的产量和品质。然而,在全球气候变化背景下,随着大气CO₂浓度和温度升高,作物-土壤氮循环的变化可能显著影响农田生态系统中的作物生产。因此,研究作物-土壤氮循环对大气CO₂浓度和温度升高的响应,能够为科学合理地预测未来气候条件下,农田生态系统中作物的氮素需求,以及保障农作物产量的稳定供应提供理论依据,对于全面认识全球气候变化背景下的农田生态系统氮素循环过程及土壤可持续利用具有重要意义。本文综述了大气CO₂和温度升高对作物氮素吸收和分配,以及与氮有效性密切相关的土壤氮转化的影响,并系统总结了二者对作物-土壤氮循环过程产生的交互作用。总结以往研究发现,在大气CO₂浓度升高条件下,作物的蒸腾作用减弱,但光合作用增强,生物量加大,根系分支和根表面积增加,豆科作物的根瘤固氮能力提高,因此整体上促进作物对氮的吸收,并且增加作物向籽粒中分配氮的比例,但作物的平均氮浓度降低。此外,高CO₂浓度提高了土壤酶活性,增强了土壤有机氮矿化作用、硝化及反硝化作用,加速了土壤氮转化。升温和CO₂浓度升高对作物-土壤氮循环产生正向或负向的交互作用,主要表现在：高温和高CO₂浓度对作物的生物量、光合作用、地下部氮分配、根系分支以及根表面积具有协同促进作用,升高温度减轻了高CO₂浓度对作物蒸腾作用和作物氮浓度的抑制作用。然而,升温抑制了高CO₂浓度对作物向籽粒中氮分配、氮吸收以及产量的促进作用;升温虽然能进一步增强高CO₂浓度对土壤酶活性和有机氮矿化的促进作用,但是对于土壤硝化和反硝化作用,二者的交互作用以及相关的分子机制尚不明确。大气CO₂升高和温度升高对土壤微生物,以及微生物与作物之间的耦合关系的研究比较薄弱,特别是由微生物主导的氮循环过程及其对全球气候变化的反馈机制是未来研究的重点。本文提出利用16S rRNA、DGGE、T-RFLP、qPCR、RT-PCR技术、蛋白组学以及稳定性同位素探针原位研究技术,可以将复杂环境中微生物物种组成及其生理功能进行耦合分析,揭示大气CO₂浓度与温度对作物-土壤氮循环过程的交互作用机理,增强对气候变化下农田生态系统氮素循环响应的预测能力,为农田生态系统有效地适应气候变化提供科学的理论依据。