表达H5N1亚型禽流感HA、NA、 M1基因的重组杆状病毒的鉴定

为证实插入了禽流感HA、NA、M1、M2、NP基因的重组杆状病毒的表达物为具有禽流感形态的病毒样颗粒,对表达产物进行电镜、Western Blot、ELISA检测。蔗糖密度梯度离心纯化表达产物,电镜观察,可见禽流感病毒样颗粒;以Western Blot方法用HA、NA、M1抗体检测表达产物和纯化产物,可见特异性条带;NA多抗为捕获抗体、HA单抗为检测抗体建立夹心ELISA方法,检测表达产物,结果为阳性。结果显示,插入了禽流感HA、NA、M1、M2、NP的重组杆状病毒能够表达禽流感病毒样颗粒。     

羟基红花黄色素A对雌激素效应相关蛋白表达的影响

目的 探讨羟基红花黄色素A（hydroxysafflor yellow A,HSYA）对雌激素效应相关蛋白表达的影响。方法 培养雌激素受体阳性细胞T47D和特异性雌激素受体（estrogen receptor,ER）阴性细胞SK-BR-3,将1×10^-7mol/L-1×10^-9mol/L三种梯度浓度的HSYA作用于两种细胞,通过蛋白质免疫印迹法检测雌激素受体ERα及ERβ、细胞外调解蛋白激酶1/2（ERK1/2）及p-ERK1/2、孕激素受体（progesterone receptor,PR）、抑癌基因P27等蛋白的表达情况。结果 与空白对照组相比,在T47D细胞中,高浓度的HSYA促进了ERα、ERβ、ERK1/2、p-ERK1/2、PR的表达,抑制了P27的表达（P<0.01）;在SK-BR-3细胞中,HSYA显著抑制了ERK1/2的表达,但对p-ERK1/2的表达影响不明显（P>0.05）。结论 HSYA在细胞内影响雌激素效应相关蛋白的表达情况不同,可能是通过调节ER表达及激活ERK信号通路而发挥雌激素样作用。     

Western blot检测家兔动脉组织蛋白质表达条件的优化

蛋白质免疫印记技术是研究和分析蛋白质的重要手段,由于其步骤繁杂、影响因素众多,常出现背景噪音高、非特异条带多、拖尾等问题,严重影响后续蛋白质定量分析。为建立最佳的检测家兔动脉组织中蛋白质表达的蛋白质免疫印记技术实验条件,以家兔动脉组织血管细胞粘附分子-1为目标蛋白,从电泳条件、抗体浓度、抗体孵育时间、温度及方法、免疫显色方法等方面进行了改良,成功建立了快速、灵敏、特异的蛋白质免疫印记技术体系;并比较了3种常用的酶免疫显色技术：3,3’-二氨基联苯胺（3,3’-diaminobenzidine,DAB）显色、增强化学发光法（enhanced chemil luminescence,ECL）X光片曝光及ECL化学发光冷却电感耦合成像系统（cooled charged-coupled device,CCD）成像的敏感性。结果表明ECL化学发光法比DAB显色法敏感性高出2～10倍,其中CCD系统敏感性高于X光片4倍,且操作简便,是最理想的检测方法。     

藏猪IGF-1成熟肽基因的克隆及原核表达

旨在克隆藏猪胰岛素样生长因子1(IGF-1)的成熟肽基因,并进行原核表达的研究。提取藏猪肝脏组织RNA,通过RT-PCR扩增出藏猪IGF-1全长基因,构建重组质粒p MD19-T-IGF-1,以p MD19-T-IGF-1质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽序列并构建成熟肽p ET-32α-IGF-1表达质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3),对IPTG诱导剂浓度和诱导时间进行优化,Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白后采用Western Blot对其鉴定。结果显示,IGF-1成熟肽基因(315 bp),成功构建了成熟肽p ET-32α-IGF-1原核表达质粒;重组大肠杆菌BL21-IGF-1以包涵体形式表达出分子量约31 k Da融合蛋白,最优IPTG浓度为0.5 mmol/L,最佳IPTG诱导时间为10 h;纯化获得了高纯度的融合蛋白,经鉴定IPTG诱导表达和纯化的蛋白为IGF-1融合蛋白。结果表明,成功构建了表达质粒p ET32α-IGF-1及获得重组大肠杆菌BL21-IGF-1,表达了藏猪IGF-1成熟肽融合蛋白及该蛋白具有抗原抗体反应活性。     

Western blot检测家兔动脉组织蛋白质表达条件的优化

蛋白质免疫印记技术是研究和分析蛋白质的重要手段,由于其步骤繁杂、影响因素众多,常出现背景噪音高、非特异条带多、拖尾等问题,严重影响后续蛋白质定量分析。为建立最佳的检测家兔动脉组织中蛋白质表达的蛋白质免疫印记技术实验条件,以家兔动脉组织血管细胞粘附分子-1为目标蛋白,从电泳条件、抗体浓度、抗体孵育时间、温度及方法、免疫显色方法等方面进行了改良,成功建立了快速、灵敏、特异的蛋白质免疫印记技术体系;并比较了3种常用的酶免疫显色技术:3,3’-二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)显色、增强化学发光法(enhanced chemil luminescence,ECL)X光片曝光及ECL化学发光冷却电感耦合成像系统(cooled charged-coupled device,CCD)成像的敏感性。结果表明ECL化学发光法比DAB显色法敏感性高出2～10倍,其中CCD系统敏感性高于X光片4倍,且操作简便,是最理想的检测方法。     

用mRNA差别显示方法分析黑麦盐胁迫下应答基因cDNA片段的表达特性

利用mRNA差别显示方法分析经250mmol/LNaCl处理3d的黑麦幼苗,14个差异cDNA片段,包括8个诱导表达片段,2个增强表达片段和4个抑制表达片段被检测到.NorthernBlot分析证实,其中0.8kb、0.65kb和0.35kbcDNA片段有强烈阳性信号,命名为SI800、SI650、SI350(SaltInduced800bp、650bp、350bp),证明与盐胁迫有关.以SI800为探针与分别经