牛病毒性腹泻病毒E2蛋白纳米抗体筛选及反应原性检测

通过噬菌体展示技术筛选牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组E2蛋白特异性纳米抗体,验证纳米抗体反应原性.使用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,分别在第0、21、49及70天采集全血,测得抗体效价后分离全血中淋巴细胞,提取总RNA,反转录后PCR扩增目的片段.目的片段和pCANTAB5E使用限制性内切酶酶切连接后转至TG1感受态细胞...     

北京地区规模化牛场BVDV持续感染牛清除方案的初步实施

BVDV持续感染牛(persistently infected,PI)是造成牛群内BVD难以根除的重要原因。为摸清北京地区BVDV-PI牛分布情况,探索BVD清除方案,本次筛查利用抗原捕获ELISA,对北京地区7个规模化奶牛场共14028头荷斯坦奶牛进行BVDV抗原检测。共检出PI牛58头,其中成母牛9头,后备牛49头;场内阳性率0.04～1.02%;PI牛与健康牛相比,平均出生体重相差5.9kg(P0.05),15月龄时体重相差94.6kg(P0.05),平均初配月龄和首次怀孕月龄分别延迟2.9个月和4.9个月(P0.05)。结果表明,PI牛个体发育缓慢且繁殖性能低下,但部分牛临床表现正常。以抗原捕获ELISA为主要检测手段的清除方案是控制BVD的有效方法。     

应用RT-PCR技术快速检测鉴定猪瘟病毒

根据所有已报道的猪瘟病毒株（HCV）和牛病毒性腹泻病毒株（BVDV）的序列设计了3条引物Pa,Pb,Pc。应用RT-PCR技术，引物对Pa/Pb从猪瘟HCLV株，猪瘟Thiveral株，3株猪瘟野毒株都扩增出了预期185bp的片断，Pa/Pc从BVDVOregonC24V株中也扩增出了240bp的片断，而Pa/Pb与牛睾九原代细胞，PK-15细胞，BVDVOregonC24V株均无反应，Pa/Pc也不与所试验的5株猪瘟毒株反应。采用多重PCR可以从同时含有HCV和BVDV核酸的样品中扩增出各自的特异性条带。针对猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCLV）的特异性插入序列。设计了引物Pr,Pra,Prb，可以从HCLV细胞毒或用HCLV人工感染的兔脾组织毒中扩增出预期200bp的片断，而Pr,Pra,Prb与猪瘟Thiveral株和3株猪瘟野毒株均不反应，通过含毒量梯度试验，得出了RT-PCR可检测猪瘟病毒量的下限为200RID或200TCID50。     

一步法RT—PCR检测大缸奶在BVDV清除计划中的应用

本文利用一步法RT—PCR对28个牛场共计50份大缸奶样进行了BVDV核酸检测。在与全群抗原检测结果对比后发现．9个已知存有PI牛的泌乳牛群,其大缸奶核酸检测均为阳性,其余41个已知无PI牛的泌乳牛群．除1个因为存在急性感染牛造成阳性结果外,其余40个均为阴性。由此可见,本方法对与泌乳牛群内是否存在PI牛可以做出准确判断,其检测灵敏度和特异性均为100％,阳性预测结果可信度为0．9（9／10）,阴性预测结果可信度为0．98（40／41）。此外．针对50个大缸奶样进行的抗体检测表明,对于已感染牛场,泌乳牛群是否存在PI牛,抗体水平没有明显差异（OD1．12±0．12vsOD1．34±0．23,P〉0．05）。实验室条件下,本试验使用的RT—PCR方法对于阳性乳的最低检出限为50uL/头,因此理论上,最多可从1000份样品中检出阳性乳成分（总体积为50mL）。综上可知,本试验确立的RT—PCR方法灵敏度高、特异性强,可对泌乳牛群是否存在PI牛进行准确预测,相比大缸奶抗体检测更具实际指导意义,联合ELISA—Ag使用时还可大幅度降低泌乳牛群BVDV清除计划的检测成本,因而值得推广使用。     

北京地区牛病毒性腹泻病毒流行传播的原因分析

在对北京地区20个奶牛群进行抗体水平检测和全群抗原筛查的基础上,将牛群中牛病毒性腹泻病毒流行状况同牛群在3年内是否引入过动物进行相关性比较。结果显示,20个牛群中,引入过动物的8个牛群中后备牛群血清抗体平均水平为80.0%,抗原筛查的总体阳性率为0.61%;未引入过动物的12个牛群中后备牛血清抗体平均水平为65.5%,抗原筛查的总体阳性率为0.15%,两组数据之间差异极显著,表明牛群在3年内是否引进过动物对牛群持续感染牛的分布影响极显著,动物引进可能是造成BVDV在北京地区流行传播的主要原因之一。     

牛病毒性腹泻病毒石河子株的分离与基因型鉴定

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea virus,BVDV)不同的基因型在抗原性方面存在差异,使疫苗免疫难以收到预期效果。本试验对分离到的BVDV石河子株和其他石河子分离株进行基因型鉴定,通过对病毒的遗传分类研究,为该病的防治和开发新的基因工程疫苗提供一定依据。采用免疫学试验、电镜观察、理化特性测定以及PCR技术、同源性比较等方法分离、鉴定1株BVDV石河子分离株,命名为BVDV shz132株,并应用系统发生分析方法鉴定该株与其他石河子分离株Manasis、hihezi148和Letuyi株的基因型。将免疫学鉴定为阳性的样品进行病毒分离,电镜观察分离的BVDV shz132株病毒直径为40~60 nm,为有囊膜的球形颗粒。理化鉴定结果与参考株BVDV Oregon C24V一致。根据BVDV基因组5-′UTR基因设计引物在发病牛淋巴结、肠道分泌物制备的悬液及其分离的病毒细胞培养物中均扩增得到了大小为267 bp的片段。核苷酸同源性分析结果表明BVDV shz132株与BVDV Osloss株的同源性最高(97.5%),BVDV Manasi株等与BVDV NADL株的同源性最高(97.8%);系统发生分析表明上述所有石河子分离株均属于BVDV-Ⅰ型。     

牛病毒性腹泻病毒Core蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的Core蛋白及其多克隆抗体,根据Core蛋白的编码基因序列,设计合成一对特异性引物,利用RT-PCR扩增BVDV Core基因并定向插入Pet30a载体中,构建重组质粒Pet30a-Core,经酶切鉴定后转化大肠埃希菌TOP 10感受态细胞,筛选获得阳性重组菌,以IPTG进行诱导后成功表达出分子质量为20 ku的重组Core蛋白。将诱导表达的蛋白产物经融合蛋白的Ni柱亲和法进行纯化,利用纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并利用间接ELISA法测出多克隆抗体效价达到1∶512 000。蛋白质印迹法(Western blot)和间接免疫荧光试验(IFA)证实,多克隆抗体可与细胞中的BVDV抗原发生反应,具有良好的免疫原性和特异性。本实验成功制备了BVDV重组Core蛋白的兔源多克隆抗体,为BVDV的检测及其Core蛋白功能研究奠定了基础。     

鹿角盘多糖抗病毒的研究

[目的]研究鹿角盘多糖的抗BVDV作用,为鹿角盘多糖在开发新型抗病毒药品方面提供参考。[方法]采用中性红染料法,测定了鹿角盘多糖对MDBK细胞的最大安全浓度。[结果]鹿角盘多糖对MDBK细胞无损伤的最大安全浓度是39μg/ml,在2～39μg/ml范围内鹿角盘多糖抗BVDV效果显著。[结论]鹿角盘多糖具有显著抗BVDV病毒作用,且有一定的量效关系,在安全浓度范围内,随浓度的提高鹿角盘多糖抗病毒的作用增强。     

Prevalence of Bovine Viral Diarrhoea Virus antibodies among the industrial dairy cattle herds in suburb of Mashhad-Iran

Mashhad is a major dairy production in Iran. The subject of this study was to survey the seroprevalence of Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV) infection using an indirect Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) test in industrial dairy cattle herds in suburb of Mashhad-Iran. Totally, 141 serum samples were tested. None of the herds had been vaccinated against BVDV. Commercial indirect ELISA kit was used. The herds divided to 3 sizes as cow population. They were included: small, medium and large herds. Data were analyzed using Chi-square test. Ninety-seven (68.79%) cows were ELISA seropositive. However, the true BVDV seroprevalence was 72.25%. All of the herds were antibody positive against BVDV. The prevalence ranged from 66 to 100% within the herds. There were no significant differences between the presence of antibodies to BVDV and the herd size (P > 0.05). The prevalence in animals lower than 2 years old differed significantly with cows higher than 2 years old (P < 0.05). According to the results, it is concluded that it is likely the presence of persistently infection (PI) animal(s) within the herds in suburb of Mashhad-Iran, which is responsible for the presence antibody.     

牛病毒性腹泻病毒血清抗体检测

采用Svanova公司牛病毒性腹泻病毒血清抗体ELISA抗体检测试剂盒对采自新疆10个不同地区的875份牛血清进行了牛病毒性腹泻病毒血清抗体检测,共检出抗体阳性血清759份,最高阳性率为100％,最低为55.0％,平均为86.7％.检测结果表明该病已在新疆普遍存在,感染没有明确的地域分布规律.根据ELISA检测结果,从...