细菌人工染色体(BAC)文库及其在小麦中的应用

细菌人工染色体（BAC）具有容量大、遗传稳定、易于操作等优点，在基因组研究和基因功能分析等方面得到了广泛应用。对BAC文库克隆载体的类型、小麦BAC文库的构建及其应用进行了综述，并对其前景进行了展望。细菌人工染色体载体是由大肠杆菌的F-因子发展而来，第一代BAC克隆载体pBAC1081能容纳300kb的片段，但它只具有转化选择标记．没有重组选择标记。第二代载体是将LacZ基因插入到多克隆位点中形成具有重组选择标记类型的载体如pBeloBACll，在该载体的基础上经过改造和改进又发展了一些特殊用途的载体，如富集基因类型和遗传转化类型的载体。近年来利用这些载体构建了小麦二倍体、四倍体、六倍体基因组BAC文库以及小麦特定染色体BAC文库，井以单克隆或混合池的形式保存。这些小麦BAC文库对于小麦基因克隆、基因组及基因区物理图谱的构建以及比较基因组学等方面的研究具有重要的意义。     

/BAC的制备及其性能研究

采用竹活性炭(BAC)作为载体,以尿素为氮源,采用溶胶-凝胶法掺杂了N元素的TiO2/BAC,然后通过等体积浸渍法负载Pt,制备了铂、氮共掺杂型光催化剂(Pt/N/TiO2/BAC)。样品的N2吸附、XRD、FT-IR、XPS等分析结果表明:掺杂后BAC的比表面积、比孔容积等均有所下降,对中孔及大孔影响更明显;Pt、N共掺杂不改变TiO2的晶型类型,有利于TiO2在活性炭表面分散,N掺杂使晶粒粒径减小,Pt掺杂对晶粒粒径影响不明显;N、Pt通过化学键与TiO2相结合,实现了晶格掺氮,在催化剂表面形成了表面活性位Pt0。样品TiO2/BAC、Pt/TiO2/BAC、N/TiO2/BAC、Pt/N/TiO2/BAC在紫外光、氙灯照射下对水溶液中甲醛的降解研究结果表明:N掺杂拓宽了催化剂的光吸收范围,Pt掺杂增强了TiO2的光催化活性;Pt/N/TiO2/BAC的甲醛去除率达到TiO2/BAC的2.6倍,并且具有良好的分离性能。     

Research on the Construction of Bacterial Artificial Chromosome Vector DNA and the Potentials in Application

[Objective] The aim of this study was to provide a method for solving the problems in preparing BAC vector with High-copy plasmid pUC119-Bluelox BAG. [Method] With 8electing a proper single restriction site, sequences of a single copy BAC vector plasmid were inserted into proper site of High-copy plasmid pUC119 vector. [Result] The gene sequence of BAG vector lost control function of single copy number in new plasmid pUC119-BAC and was copied through High-copy form. The gene sequence of BAC vector basic function was completely cutted off through single enzyme digestion and the control function of single copy could be recovered by auto-connection. [ Conclusion ] The High-copy pUC119-BAC plasmid was used to copy and amplify high copy of basic function gene sequence in BAG vector, besides thai it could be used to construct transfer vector of molecular cloned recombinant virus or BAC library.     

红鳍东方鲀BAC数据库和ESTs数据库中微卫星的筛选与应用

利用Tandem Repeats Finder软件在红鳍东方鲀Takifugu rubriper BAC数据库和ESTs数据库中查找微卫星标记.选取其中22个序列(11个BAC-SSRs序列、11个EST-SSRs序列)设计引物,并将22对引物用于庄河、河北Ⅰ和河北Ⅱ3个群体,均能扩增出产物,其中EST-SSRs有2对引物扩增产物比预期扩增产物偏大,可能是相应基因组中有内含子导致.研究结果表明,EST-SSRs标记要比BAC-SSRs标记的多态性低,其中11个BAC-SSRs和9个EST-SSRs标记有很好的多态性,可以用于红鳍东方鲀的遗传多样性分析和重要经济性状筛选等方面的研究.     

猪脂联素基因启动子克隆及多态性研究

[目的]为脂联素基因作为脂肪沉积候选基因的研究提供依据。[方法]通过猪BAC文库筛选及primer—walking的测序方法获得脂联素基因的启动子序列,采用PCR—RFLP技术对蓝塘猪、大花白猪、大白猪、长白猪和杜洛克猪5个品种共290头猪的脂联素基因启动子区的多态性进行了分析。[结果l脂联素基因的5’侧翼区-1010bp（G／A）的SNP位点,本地猪种中GG基N型频率明显高于外来猪种;-394bp（T／C）的SNP位点,本地猪种基因型分布较为丰富,而在外来猪种申却没有检测到CC基因型,且外来猪中T等位基因频率较高。[结论]脂联素基因上游-1010bp（G／A）的SNP位点突变可能会引起该基因转录水平的改变,而-394bp（T／C）的SNP位点与基因转录水平及与脂肪沉积可能无关．     

抗稻瘟病链霉菌JK-1基因组BAC文库构建

实验以抗稻瘟病链霉菌JK-1的基因组DNA为材料构建了其BAC（bacterial artificial chromosome）文库。该文库共有3456个克隆,插入片段在40-100kb,平均插入片段55kb,空载率低于5%,覆盖了链霉菌基因组约17.3倍。抗稻瘟病链霉菌JK-1基因组BAC文库的构建,为进一步研究基因组结构及其功能基因的利用等奠定了基础。     

高产优质抗病棉花品种中棉所12号细菌人工染色体(BAC)文库构建

中棉所12号是我国自育的高产、优质、抗枯萎病、耐黄萎病棉花品种，其重要创新是使抗性和产量、品质得到结合改良和提高。本研究以plndigoBAC-5为载体，对中棉所12号进行了细菌人工染色体(BAC)文库构建。初步建立的文库含有38800个克隆，覆盖2倍基因组。对文库中132个重组克隆的分析表明：插入片段为50～150kb，平均大小为120kb；大于100kb的克隆占87．7％，大于110kb的克隆占56％；空载率小于1％。该文库的构建为深入开展棉花基因组有关研究奠定了基础。     

稻瘟病菌细菌人工染色体（BAC）基因组文库的构建

 稻瘟病菌是一种重要的植物病原菌,同时又是研究植物和病原物之间相互关系的一个重要试验系统。实验通过采用95-23-4a稻瘟病菌株经提取纯化得到该稻瘟病菌的细胞核基因组总DNA,用限制性内切酶部分酶解后,与经末端去磷酸化处理过的pCUGIBAC1质粒载体按一定摩尔比例相互连接,通过转化E.coli DH10B感受态细胞进而通过蓝白斑筛选挑取白色克隆从而构建了95-23-4a稻瘟病菌株的细菌人工染色体（BAC）基因组文库。通过进行酶切检测及Southern杂交分析后确定所构建的BAC文库平均插入片段29.1 kb,该文库覆盖7.4倍基因组,此基因组文库的构建为该菌致病相关基因的克隆奠定了基础。     

A deep-coverage BAC library for Ponkan mandarin and its further use in screening ethylene regulated genes

A deep-coverage bacterial artificial chromosome (BAC) library of Yanxiwanlu Ponkan, a late maturing cultivar, was constructed and evaluated. Results showed that the library contained a total of 61,000 clones. Restriction analysis indicated that the DNA insert sizes ranged from 30 to 170 kb with an average of ∼82 kb. No empty clone was found. Therefore, the library should cover ∼13.6-fold of the citrus genome. Continuous sub-cultivation of 5 randomly chosen clones for up to 100 generations showed no detectable change in their restriction profiles. To demonstrate the application of the library in discovery of genes, 7 ethylene-regulated genes were screened by PCR amplification from hierarchically pooled library clones with gene-specific primers. Five positive clones, each representing a different gene, were thus identified from 3840 clones. Sequencing of the clones showed that all of them matched the expected genes, indicating that the library was highly representative.     

猪脂联素基因启动子克隆及多态性研究（摘要）

[目的]为脂联素基因作为脂肪沉积候选基因的研究提供依据。[方法]通过猪BAC文库筛选及引物步移法（primer-walking）的测序方法获得脂联素基因的启动子序列,具体步骤：通过已经发表的部分猪脂联素基因cDNA序列设计特异引物用于BAC克隆的筛选。以超级池DNA为模板进行第1次PCR反应,筛出含阳性克隆的超级池;以挑出的阳性超级池的3维池DNA为模板进行第2次PCR反应,根据阳性板池、列池、行池序号得到可能的阳性克隆号;依照阳性克隆号从工作文库中取出相应的BAC克隆,平板划线37℃倒置培养20 h。待菌落长好后,做菌体PCR鉴定,以确认克隆的正确性。将获得的BAC阳性克隆平板划线,37℃摇菌过夜培养,进行BAC的提取、纯化与酶切回收。先以M13引物向BAC两端测序,再以发表的cDNA序列外显子1设计测序引物采用primer-walking的方法,获得连续的DNA序列。采用PCR-RFLP技术对蓝塘猪、大花白猪、大白猪、长白猪和杜洛克猪5个品种共290头猪的脂联素基因启动子区的多态性进行分析。[结果]脂联素基因的5′侧翼区-1 010 bp（G/A）的SNP位点,本地猪种中GG基因型频率明显高于外来猪种;-394 bp（T/C）的SNP位点,本地猪种基因型分布较为丰富,而在外来猪种中却没有检测到CC基因型,且外来猪中T等位基因频率较高。[结论]脂联素基因上游-1 010 bp（G/A）的SNP位点突变可能会引起该基因转录水平的改变,而-394 bp（T/C）的SNP位点与基因转录水平及与脂肪沉积可能无关。