鱼腥藻PCC 7120 基因alr0267敲除及其功能的初步研究

【目的】敲除鱼腥藻PCC 7120的alr0267基因,并对其功能进行初步研究。【方法】克隆获得鱼腥藻PCC 7120 alr0267基因部分片段,通过构建敲除载体,使其与目的基因发生单交换同源重组,从而将鱼腥藻PCC 7120中的alr0267基因敲除,并对敲除体进行纯化和PCR鉴定,然后对alr0267敲除体和野生型固氮异形胞进行形态观察和统计,同时采用实时荧光定量PCR,在培养不同时间(0,3,8,24h和10d)检测野生型和alr0267基因敲除体中与异形胞功能相关基因all0813、all2736、alr2887的相对表达量。【结果】鱼腥藻PCC 7120 alr0267基因被成功敲除;在缺氮条件下培养6~12d,敲除体异形胞营养细胞数的均值明显少于野生型;实时定量PCR分析表明,野生型中all0813、all2736、alr2887基因表达量均在培养24h达到最大,敲除体中这3个基因最大相对表达量的出现时间均有所延迟。【结论】alr0267基因敲除导致异形胞分化频率增加,同时影响异形胞的正常发育。     

白斑综合征病毒(WSSV)基因VP28原核表达与检测

VP28是对虾白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV) 的囊膜蛋白。将VP28基因序列密码子优化后合成,经限制性内切酶Nde I、Xho I酶切后,按正确的阅读框顺序插入到pET-28a( )表达载体上。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经质粒双酶切、测序鉴定后,证实成功地构建了 VP28 基因原核表达载体pET-28a-VP28。转化菌经 IPTG 诱导,SDS-PAGE 显示含有与预期大小一致的约30kDa蛋白带,主要以包涵体形式表达。采用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了纯度为95%的大肠杆菌重组蛋白VP28。该纯化蛋白作为绝对定量Western的标准品,梯度稀释建立标准曲线,以定量检测转基因鱼腥藻7120中的VP28绝对表达量。实验结果表明,大肠杆菌BL21(DE3)表达的重组蛋白VP28与鱼腥藻7120中表达的VP28分子量基本相同,纯化后的大肠杆菌重组蛋白梯度稀释作为绝对定量Western标准曲线,计算出转基因鱼腥藻7120在培养第17天时,VP28的表达量最大,为5.14μg/mL,占转基因鱼腥藻7120总蛋白浓度的1.45%。这不仅对转基因鱼腥藻的高效培养具有重要意义,也为日后确定投喂对虾口服疫苗有效剂量防治白斑综合症奠定了基础。     

MreB在鱼腥蓝细菌PCC 7120细胞分裂过程中的功能

为研究Anabaena sp. PCC 7120中的细胞形态决定蛋白MreB的亚细胞定位和功能,构建了由mreB自身启动子驱动的mreB-gfp融合载体,通过接合转移的方法将其转化到野生型Anabaena sp. PCC 7120中,获得绿色荧光蛋白标记的MreB的鱼腥蓝细菌菌株,同时用MreB的抑制剂A22处理菌株。结果显示,MreB的亚细胞定位随着细胞周期的进程而发生变化,A22处理可导致MreB无法正确聚合定位。