猪瘟病毒E2蛋白研究进展

猪瘟（Classical Swine Fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus,CSFV）引起的一种急性、接触性传染病。目前该病流行于除北美洲和大洋洲以外的其他大洲和地区,呈世界性分布,在一些原已宣布消灭猪瘟的欧洲国家（荷兰、比利时、英国、德国、意大利、西班牙等）又相继复发。虽然我国长期坚持全面接种猪瘟兔化弱毒疫苗,但目前猪瘟在我国依然存在,流行特点从以往的频发大面积流行转变为无规律区域性的散发,隐性持续性感染病例增多,因此应明确猪瘟病毒的基因组结构和最具免疫防制研究价值的抗原蛋白结构,为研制新型有效的疫苗和诊断试剂提供理论依据。本文就猪瘟病毒的基因组结构、猪瘟病毒E2蛋白的结构、功能、所包含的抗原表位以及E2蛋白的表达应用等方面的研究进展作以综述。     

重组GP5AB蛋白间接ELISA检测PRRSV抗体方法的研究

利用GST-GP5AB重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的间接ELISA方法。抗原最适包被浓度为2μg/mL,最佳封闭液为0.15%BSA,37℃封闭2 h后,再4℃封闭24 h,血清最适稀释度为1∶200,其作用时间为60m in,酶标抗体最适稀释度为1∶20 000,最适作用时间为90 m in,37℃显色10 m in,S/P≥0.284为阳性,S/P≤0.26为阴性,介于二者之间为可疑的判定标准。该抗原与猪其他4种临床症状类似的疾病的阳性血清反应呈阴性。批内和批间重复性试验结果,变异系数均小于7%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用本方法初步检测了一些疫苗免疫仔猪血清样品,并与重组N蛋白和PRRSV抗原同时进行比较,结果显示3种抗原检测的结果基本一致。     

含非洲猪瘟病毒核酸序列病毒样颗粒的研制及其在检测方法中的应用

非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的烈性传染病,为了保证其检测结果的准确性和可靠性,需要研制试剂盒中使用的阳性标准质控品。本试验旨在研制含ASFV核酸序列的病毒样颗粒,并探究其在检测方法中的应用。首先扩增p72基因的全长片段,利用昆虫杆状病毒系统,包装出含有p72基因的ASF DNA病毒样颗粒。为了进一步验证该病毒样颗粒在应用中的可靠性,本研究将病毒样颗粒与ASF的组织毒及细胞毒同时进行DNA核酸提取,进行实时荧光定量PCR。结果表明,本研究制备的病毒样粒子能很好的取代ASFV在实时荧光定量PCR检测方法中作为阳性质控品,且能对核酸提取过程进行质控,实时荧光定量PCR检测试剂盒中,病毒样粒子的最低包装浓度为10² TCID₅₀。进一步研究发现该病毒样颗粒也适用于普通PCR及LAMP检测方法中,最低浓度分别为10³和10¹ TCID₅₀。本试验结果将为规范ASF检测方法,促进ASF检测方法的转化应用及保证检测结果的准确度和可靠性提供科学依据。     

大肠杆菌新型菌毛(F1987)的基因定位

对动物产肠毒素性大肠杆菌 (ETEC)的一种新型菌毛 (F1987)进行了相应基因的定位研究 ,通过对表达该新型菌毛 (F1987)相应 ETEC菌株的培养、质粒提取、对大肠杆菌受体菌株 DH5α的转化及阳性转化子筛选与相应菌毛表达的检定等 ,初步表明该新型菌毛 (F1987)的基因定位于质粒上     

猪H3N2亚型流感病毒受体亲和性鉴定

利用固相酶联方法对分离自吉林省猪群中的3株H3N2亚型流感病毒进行了受体亲和性鉴定.结果显示,这3株病毒与SAα2,3和SAα2,6受体都能结合,并且偏嗜SAα2,6受体,暗示它们具有感染人的潜能.因此应该加强猪流感的流行病学调查,及时发现那些具有引发人流感流行潜能的病毒,为防控人间流感提前做好准备.     

带有GFP的小鼠Sox2基因逆转录病毒载体的构建及其检测

为了建立体细胞重编程过程中检测Sox2基因表达变化的方法,本研究利用克隆获得的小鼠Sox2基因与逆转录病毒载体pMX—IRES—GFP连接,构建带有报告基因GFP的逆转录病毒载体,将其转染293GP细胞后获得假病毒上清。将获得假病毒上清侵染小鼠成纤维细胞（NIH3T3细胞）后观察GFP的表达和检测Sox2转录量的变化。其结果,成功构建带有GFP的Sox2基因逆转录病毒载体pMX—Sox2-IRES—GFP;将构建的载体转染后293细胞后获得能侵染NIH3T3细胞的假病毒上清,且与未侵染的NIH3T3细胞相比,侵染后的NIH3T3细胞的Sox2表达量提高近10倍。本研究为开展在体细胞重编程过程中Sox2表达与重编程效率的相关性提供依据．     

禽流感病毒分子生物学的研究进展

禽流行性感冒(av ian in fluenza,A I,简称禽流感)是由A型禽流感病毒(av ian in fluenza v irus,A IV)引起的禽类烈性传染病。作为被世界动物卫生组织(O IE)定为A类的传染病,A I不仅给世界养禽业造成了巨大的经济损失,而且对人类健康和生命安全构成了严重威胁。因此,A I已经成为人们关注的焦点,国内外学者也对其进行了大量研究。作者从病原基因组及其编码的蛋白质、致病力、变异性以及对人类感染A IV的分子机制等角度就A IV的分子生物学研究作一综述,为防制A I提供理论基础,并在此基础上探讨了人类禽流感的防治措施,加深人们对A I的认识。     

新孢子虫dNcSRS2重组蛋白间接ELISA的建立及其应用

利用新孢子虫体外重组表面蛋白dNcSRS2蛋白作为包被抗原，对各项条件进行优化，确定判定标准，建立了检测新孢子虫血清抗体的间接ELISA方法。经对多例血清检测表明，所建立的诊断试剂盒重复性好、特异性强、灵敏度高，与进口的IFAT及两种商品化ELISA试剂盒的检测结果相比较，符合率均达到92％以上。应用建立的ELISA方法对236份奶牛血清的新孢子虫抗体进行检测，阳性率为22％。这是国内首次利用重组蛋白建立的诊断试剂盒，该方法的建立将为牛新孢子虫病的诊断与流行病学调查提供有效的技术手段。     

H3亚型猪流感病毒荧光定量PCR检测方法的建立

通过RT-PCR方法克隆了H3亚型猪流感病毒HA基因一段靶序列,构建重组质粒作为标准阳性模板.根据GenBank中的H3亚型猪流感病毒HA基因保守序列设计了用于FQ-PCR的1对引物和1条TaqMan探针.通过条件优化,以10倍系列稀释的质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增,并制作标准曲线,建立了检测H3亚型猪流感的荧光定量PCR方法.结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为109～100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×109、1.0×108、1.0×107拷贝/μL的标准品的最终实际测得值(Ct)分别为13.68,18.21和20.57;变异系数分别为0.31%、0.17%和0.12%,均小于5%,说明此方法具有良好的准确性和重现性.对阳性组织病料的检测表明,该方法的检测灵敏度高出常规PCR,与套式PCR具有相近的灵敏度.     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒双重液相基因芯片检测方法的建立

为了实现快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)并同步鉴别高致病性PRRSV毒株(HPPRRSV),根据PRRSV囊膜蛋白GP2基因保守序列和HP-PRRSV特有的Nsp2基因区保守序列设计特异扩增引物和杂交探针,通过双重一步法RT-PCR不对称扩增和双重微球杂交反应,建立了双重液相基因芯片方法。对12株PRRSV以及其他12种猪病原体的检测显示,该法能特异性检测12株PRRSV毒株并准确鉴别其中7株HP-PRRSV,与其他病原体无交叉反应;对PRRSV、HP-PRRSV病毒液的检测低限均小于每个反应0.5TCID_(50);其组内、组间检测变异系数均10%;检测55份疑似临床样品并与商品化荧光RTPCR试剂盒比较检测结果,符合率达98.2%(54/55)。研究结果为适应临床快速检测PRRSV提供了一种新的分子生物学检测方法。