慢病毒介导的CRISPR/Cas9敲除TGF-β1基因对鹿茸软骨细胞增殖的影响

为探究TGF-β1基因在鹿茸快速生长期的作用,利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,设计并构建3条靶向梅花鹿TGF-β1基因第1外显子的gRNA寡核苷酸序列,在人胚肾细胞293T内进行慢病毒包装,通过neo抗性筛选稳转细胞株。提取稳转细胞株总蛋白,经BCA法测定总蛋白质量浓度,Western Blot检测TGF-β1蛋白的相对表达水平;MTT法检测TGF-β1基因敲除对鹿茸软骨细胞体外增殖的影响。结果表明:成功构建了靶向梅花鹿TGF-β1的CRISPR/Cas9基因敲除载体p BOBI-gRNA2。TGF-β1基因的缺失抑制了鹿茸软骨细胞的体外增殖。     

鹿茸增产技术

鹿茸是养鹿生产的主要产品，每年脱换1次，头茬茸主要收获二杈茸（梅花鹿，每年6月下旬）和四杈茸（马鹿，每年5月底6月初），收获头茬茸后，于8月25日前收获再生茸。如果头茬茸收获过晚或技术不得当，就不能生长再生茸。提高头茬茸的产量和质量对于养殖场是至关重要的，同时，提高再生茸的产量也可增加经济效益。影响鹿茸生长的因素很多，主要是营养、环境、管理等方面，其中营养是主要因素。     

MiRNA－93－5p 对 VEGF 的转录调控及其与梅花鹿茸细胞增殖的关系1）

为了探讨miRNA－93－5p对梅花鹿血管内皮生长因子（ VEGF）的转录调控作用及其与鹿茸细胞生长的关系,分离了鹿茸顶端软骨组织细胞,利用Trizol试剂法提取细胞总RNA,反转录合成cDNA。根据GenBank已发表的相关序列设计梅花鹿VEGF基因的3′端非编码区部分序列（3′UTR）特异引物并进行克隆,构建VEGF基因的3′UTR野生型及其突变体序列双荧光素酶报告基因载体并进行荧光素酶活性检测。再将人工合成的miRNA－93－5p模拟物转染鹿茸软骨细胞,MTT法检测鹿茸细胞体外增殖的变化;Western blotting分析VEGF蛋白的表达丰度。结果表明：成功获得了鹿茸组织VEGF基因的3′UTR序列,野生型序列长度为356 bp,突变体长度为336 bp。荧光素酶活性检测结果表明,转染野生型质粒组细胞荧光素酶活性降低,而转染突变体组细胞荧光素酶活性无明显变化。 MTT法和Western blotting结果显示,鹿茸细胞的体外增殖受到抑制,VEGF蛋白的表达水平下降,且呈时间依赖性。     

微切变—助剂互作技术与超微粉碎技术加工的鹿茸粉对小鼠生长繁殖性能的影响

应用微切变—助剂互作技术和超微粉碎技术加工鹿茸获得鹿茸微切助粉和超微粉,采用有机溶剂索式提取法和热水浸提法提取鹿茸微切助粉和超微粉中的雌二醇、孕酮和睾酮性激素,用放射免疫法分析微切助粉和超微粉中性激素的溶出量;将鹿茸微切助粉和超微粉以2g/kg的比例分别添加到粉末状商品鼠粮中混匀,重新压制成棒状鼠粮,连续饲喂昆明小鼠9周。通过分析其对小鼠生长繁殖性能的影响,评价了微切变—助剂互作技术和超微粉碎技术加工鹿茸的应用效果。结果表明,运用微切变—助剂互作技术提取的鹿茸微切助粉中的雌二醇、孕酮和睾酮的溶出量均高于超微粉碎的鹿茸粉,尤其是水作为溶剂提取的雌二醇的溶出量是超微粉碎的15.5倍。饲喂含鹿茸微切助粉鼠粮的小鼠与饲喂含鹿茸超微粉鼠粮的小鼠相比,雄鼠的精子数、a级精子数和精子活力均高,具有统计学意义(p0.05);卵巢和子宫的发育指数明显高于超微粉组,动情周期也比超微粉组短,血清中雌二醇、孕酮和睾酮性激素浓度显著增加(p0.01);孕鼠的胚胎数量较多,发育较快,哺乳期仔鼠的生长也较快。以上结果充分证明,应用微切变—助剂互作技术加工鹿茸,能够高效释放目标活性物质。     

鹿茸的采收与加工

论述了鹿茸的收获和加工关键工艺。     

带血鹿茸的加工方法

鹿茸加工的主要目的是脱水、干燥、防腐、消毒、保形、保色，提高质量，利于长期保存。目前普遍采用带血茸的加工工艺，通过全国各大鹿场的反复实践，总结出一套比较省时、省力、操作简便、干茸质量高的方法，现介绍如下：     

塔里木马鹿应用增茸灵效果对比试验

本文作者对新疆塔里木马鹿使用增茸灵进行增茸效果对比试验 ,测定结果表明 :对体格健壮的成年公鹿头茬茸锯后 ,在耳根后皮下注射 6 ml增茸灵 ,在环境、营养、饲养管理相同条件下 ,进行 110天的对比试验 ,试验组和对照组的第二茬鲜茸量平均为 1384 g和 76 1g,其二茬茸增茸效果差异极显著 (P<0 .0 1)。说明增茸灵运用于新疆塔里木马鹿生产 ,具有显著的增茸效果和较好的经济效益。     

鹿茸醇提物对用环磷酰胺处理的小白鼠生理生化指标的影响

用环磷酰胺处理小白鼠 ,就鹿茸醇提物对小白鼠的影响进行实验研究 ,用以探讨鹿茸醇提物对小白鼠的作用及作用机制。结果表明 :鹿茸醇提物组 (即实验组 )小白鼠血清钙、镁、磷含量分别为 2 2 4± 0 0 3mmol/L、 1 6 5± 0 0 2mmol/L、 2 2 8± 0 0 4mmol/L ,对照组则分别为 2 1 2± 0 0 3mmol/L、 1 6 4± 0 0 3mmol/L、 2 2 9± 0 0 3mmol/L ,两组相比 ,无显著性差异 (p >0 0 5 ) ;实验组小白鼠血清中高密度脂蛋白 (HDL)、总胆固醇 (CHO)、甘油三酯(TG)含量分别为 1 4 8± 0 0 7mmol/L、 2 0 7± 0 1 0mmol/L、 0 78± 0 0 8mmol/L ,对照组则分别为 1 1 5± 0 0 9mmol/L、 2 1 3± 0 1 5mmol/L、 0 82± 0 0 5mmol/L ,与对照组相比 ,实验组HDL较高 ,有显著差异 (P <0 0 5 ) ,总胆固醇、甘油三酯较低 ,差异不显著 (P >0 0 5 ) ;实验组小白鼠血清总蛋白、白蛋白、球蛋白分别为 74 6± 0 5 6g/L、 2 5 2± 0 2 9g/L、 49 4± 0 73g/L ,对照组则分别为 6 2 1± 0 2 3g/L、 2 1 3± 0 2 1g/L、 40 8± 0 2 5g/L ,实验组总蛋白、白蛋白、球蛋白极显著高于对照组 (P <0 0 1 )实验组小白鼠体重增加 2 37± 0 1 8g/只 ,而对?     

IGF1对生长30d鹿茸的体外培养鹿茸生长中心干细胞的影响

【研究目的】利用细胞培养技术,探讨胰岛素样生长因子（IGF1）对生长30d的鹿茸体外培养不同代数梅花鹿鹿茸生长中心干细胞（鹿茸干细胞）的影响;【方法】原代分离、培养生长30d的鹿茸的梅花鹿鹿茸干细胞．将第2代、5代、8代鹿茸干细胞经含有不同浓度的IGF1（0,1,3,和10nM）作用后,在培养24h后用3H．胸腺嘧啶核苷测定法检测每分钟衰变数（DPM）值;【结果】取材于生长30d鹿茸的干细胞,全部IGF1处理组（1,3,10nM）都显著高于对照组（0nM）（p〈0．01）。3个不同浓度IGFI处理组的平均值和最高值都是离体培养2代的细胞最低（分别为2987和3743DPM／mg蛋白）,而培养5代的细胞最高（分别为10320和12180DPM／mg蛋白）．第8代的细胞又开始下降（分别为8754和11568 DPM／mg蛋白）;【结论】IGF1能够促进鹿茸干细胞分裂增殖,生长30d鹿茸的干细胞在离体培养,不同培养时期的鹿茸干细胞对IGF1刺激的敏感度不同。