GnRHR在不同日龄建昌黑山羊睾丸、附睾中的分布与表达

[目的]定位并比较不同日龄建昌黑山羊睾丸及附睾中GnRHR的分布及表达情况。[方法]分别收集55、104、300、1 140日龄建昌黑山羊的睾丸、附睾头和附睾尾组织,然后进行脱水、包埋、切片后,采用免疫组化定位GnRHR在各个组织中的分布。[结果]GnRHR在建昌黑山羊睾丸、附睾头和附睾尾组织细胞中均有分布,在上皮下层、基质层中分布较多,其表达量在300日龄的附睾尾和1 140日龄的睾丸中达到较高水平。[结论]GnRHR在睾丸、附睾中均有表达,而且不同日龄阶段表达存在组织细胞特异性。     

GPX5在成年绵羊附睾中的表达与蛋白定位

【目的】研究谷胱甘肽过氧化物酶-5（glutathione peroxidase type-5, GPX5）在成年绵羊附睾的表达特征以及GPX5蛋白在附睾中的定位,为绵羊精子在附睾中抗氧化机制的研究提供理论依据。【方法】采取年龄相近的成年蒙古绵羊的附睾、睾丸和输精管。每一只公羊的附睾分别按照附睾头、附睾体和附睾尾进行分割。样品保存于-80 ℃冰箱,采用实时荧光定量PCR和Western blotting的方法,对成年绵羊的附睾、睾丸和输精管的GPX5 表达量进行分析。将新鲜的组织样品各部分切取适合大小浸泡于4%多聚甲醛溶液中24h,按照石蜡切片的方法制做组织切片。用GPX5特异性抗体孵育组织切片,利用DAB显色试剂盒对阳性信号进行标记。【结果】实时荧光定量PCR结果显示,成年绵羊附睾头GPX5基因的表达量极显著高于附睾体和附睾尾（P＜0.01）,而在输精管和睾丸几乎不表达。Western blotting的结果显示,GPX5蛋白在成年绵羊附睾头高表达,在附睾体和附睾尾有微量蛋白存在,睾丸和输精管中未发现GPX5蛋白。这表明GPX5主要在成年绵羊附睾头表达;经过免疫组化染色分析,GPX5蛋白主要位于附睾头上皮细胞质以及静纤毛,附睾体和附睾尾中的GPX5蛋白主要集中在静纤毛。在附睾头、附睾体和附睾尾中的精子上以及附睾腔都可以观察到GPX5蛋白,表明GPX5蛋白从附睾上皮分泌到附睾腔中,随着精子在附睾中的运输与精子结合。【结论】在成年绵羊附睾中,GPX5主要由附睾头上皮细胞合成和分泌,在附睾管腔中与精子结合,为精子功能的正常发挥提供保护。     

冬眠中华鳖雌、雄生殖道的精子储存

应用光镜和电镜技术,系统观察冬眠中华鳖(Trionyx sinensis)雌、雄生殖道的精子储存情况,显示与精子储存相关的形态结构和细胞特征。结果表明,中华鳖在冬眠期生精活动处于相对静止状态,仅有1～3层精原细胞排列在睾丸曲细精管基膜附近,其余生精细胞排列松散而紊乱,生精上皮中未见有各级细胞规律性排列,不能形成完整的管壁。附睾管腔增大,腔中储存有大量精子。附睾上皮及附睾管腔中见有PAS反应阳性物质。附睾上皮主要由主细胞、亮细胞和基细胞组成。超微结构显示,附睾上皮细胞中含有大量分泌颗粒,内质网膨大。储存在附睾中的精子结构完整,精子中段由35～40个同心圆状线粒体构成线粒体鞘,中段胞质中含有大量糖原颗粒。雌性输卵管分布着数量不等的精子,尤其狭部最多。狭部黏膜皱襞高度融合,形成大量纵行于输卵管的储精细管。在细管中含有大量精子,精子头部嵌入上皮细胞纤毛中。蛋白部和子宫部也有少量精子存在,但在这些部位不能形成明显的储精细管。PAS反应显示,输卵管狭部储精细管上皮分泌有糖蛋白类物质。储精细管上皮下固有层中分布有大量的管状腺,通过腺导管与输卵管管腔相通。雌、雄中华鳖隔离4个月(12月初至来年3月底)后,在雌性输卵管峡部的储精细管中仍可观察到大量结构完整的精子,表明中华鳖精子在输卵管中至少可以储存120 d。以上结果显示,在冬眠期,雄性附睾和雌性输卵管中有大量精子储存,储存的精子能够渡过漫长的冬季用于来年春天交配或受精,这一特殊的生殖策略对其成功繁殖具有重要意义。本研究还对中华鳖的繁殖特性进行了讨论。     

山羊PHGPx基因在不同组织中的表达特点及性腺中的定位

【目的】研究磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)在山羊各种组织中的表达特点及在性腺中的定位情况。【方法】提取各种组织总RNA,应用实时荧光定量PCR方法检测各种组织PHGPx mRNA表达规律,利用免疫组化技术对睾丸和附睾PHGPx进行定位分析。【结果】PHGPx mRNA在各种组织表达水平由高到低依次为:睾丸心脑附睾肾肝肺脾背最长肌,在性腺和附睾中:睾丸附睾尾附睾头附睾体;免疫组化结果显示睾丸间质组织、生精细胞均有阳性产物,附睾头部平滑肌纤维表达弱阳性,附睾尾部附睾管中的单层柱状上皮表达呈强阳性。【结论】PHGPx在不同组织广泛表达,发挥重要的生物学功能,免疫组化结果直观显示了睾丸及附睾表达差异的部位,需深入研究其作用机制。     

CYP19基因在牦牛睾丸及附睾组织中的表达定位

[目的]为了探讨CYP19基因在牦牛睾丸及附睾不同部位的表达差异性.[方法]应用免疫组织化学、qRT-PCR方法、Western-blot等检测方法,研究成年牦牛睾丸及附睾头、体、尾等4个组织中CYP19基因的表达和定位.[结果]免疫组化结果显示在睾丸支持细胞、间质细胞和生殖细胞中P450arom蛋白均有较强表达,在附...     

3β-HSD在初情期从江香猪附睾中的特异性表达模式

3β-羟基甾脱氢酶（3β-HSD）特异性表达于从江香猪的附睾组织中，并且在初情期时表达量最高。而目前对3β-HSD在初情期附睾不同区段的研究未被报道，因此本实验以香猪不同区段的附睾组织作为实验对象，通过使用免疫组织化学（IHC）与蛋白质免疫印迹（WB）分析3β-HSD在初情期香猪附睾5个区段（Ⅰ-Ⅴ区）的具体表达位置和表达量。IHC结果显示3β-HSD定位于香猪附睾的5个区段，且主要定位于附睾管上皮周围的平滑肌、管腔内附睾液及管腔微绒毛中。WB结果显示3β-HSD在Ⅳ区的表达量最高，并且显著高于Ⅰ区、Ⅱ区、Ⅲ区及Ⅴ区。此外，Ⅲ区的表达量显著高于Ⅰ区，但3β-HSD在Ⅰ区、Ⅱ区和Ⅴ区的各组之间并无统计学差异。综上，本研究发现3β-HSD在初情期香猪附睾定位于附睾管管周平滑肌、管腔内附睾液及管腔微绒毛，表达量以Ⅳ区最高，并且以区段特异性表达。     

EGF促进绵羊附睾上皮细胞体外增殖的研究

【目的】探讨表皮生长因子(EGF)对体外培养的绵羊附睾上皮细胞(EECs)增殖的影响。【方法】分离培养EECs,利用免疫荧光检测角蛋白18(CK18)对分离的细胞进行鉴定,用CCK-8法测定EGF的最佳作用质量浓度,用RT-PCR检测EECs中附睾分子标记——谷胱甘肽过氧化物酶-5(GPX5)和雄激素受体(AR)基因的表达情况,用流式细胞仪法检测EGF对EECs细胞周期和凋亡的影响。将P_4代EECs分别用表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂Gefitinib、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路抑制剂LY294002和DMSO(对照组)处理后,再用EGF培养,用流式细胞仪法检测细胞周期和凋亡情况。将P_4代EECs分别用EGF(-)、EGF、EGF+Gefitinib和EGF+LY294002处理后,用Western blot检测细胞中EGFR、AKT和叉头盒蛋白O1(FOXO1)磷酸化水平。【结果】分离培养的EECs可表达CK18,细胞纯度较好;EGF对EECs增殖促进效应呈浓度依赖性,用含50 ng/mL EGF培养基培养的EECs具有最高的增殖潜能,且不同传代EECs细胞均可正常表达GPX5和AR;EGF处理S期EECs细胞比例极显著升高(P0.01),凋亡指数显著降低(P0.05)。与对照组相比,Gefitinib组S期EECs细胞比例极显著降低(P0.01),LY294002组S期细胞比例显著降低(P0.05);Gefitinib组EECs细胞的凋亡指数极显著升高(P0.01),而LY294002组EECs细胞的凋亡指数无显著变化。EGF组中EECs细胞的EGFR、AKT和FOXO1磷酸化水平较高;与EGF组相比,EGF+Gefitinib组中EECs细胞的EGFR、AKT和FOXO1磷酸化水平明显降低,而EGF+LY294002组中EECs细胞的AKT和FOXO1磷酸化水平明显降低。【结论】EGF可增强绵羊EECs体外生长活力,其作用机制可能是EGF通过介导EGFR和PI3K/AKT信号通路上调了FOXO1的磷酸化水平。     

纳米锌水平对公羊精液品质、抗氧化酶活性及附睾Cu-ZnSOD表达的影响

【目的】微量元素锌是动物正常繁殖所必需的元素,研究旨在了解日粮纳米锌对公羊精液品质、抗氧化酶和附睾Cu-ZnSOD蛋白表达的影响,分析公羊精液品质参数与精浆抗氧化酶活性的相关性。【方法】将16只9月龄健康状况良好体重相近的晋中绵羊公羊,随机分成4组,分别喂给基础日粮（对照组）,基础日粮+50 mg·kg^-1、100 mg·kg^-1和150 mg·kg^-1 DM纳米锌。试验期90 d。在试验78 d和79 d连续两天采集精液,每次采集精液取出100 µL评价精液品质参数,剩余精液离心分离精浆,测定精浆Cu-ZnSOD、GPxs活性及总抗氧化能力;试验结束时,用手术去势法采集附睾头、附睾体和附睾尾组织,采用免疫组化技术对附睾头、附睾体和附睾尾中Cu-ZnSOD进行定位,并用Image Pro Plus 7.0软件分析的平均光密度值进行Cu-ZnSOD蛋白定量。【结果】日粮纳米锌对公羊射精量影响差异不显著（P＞0.05）。与对照组相比,添加50 mg·kg^-1或100 mg·kg^-1纳米锌组公羊的精子密度、精子活力和精子质膜完整性显著增加（P＜0.05）,精子畸形率显著降低（P＜0.05）;添加150 mg·kg^-1组精子质膜的完整度显著增加（P＜0.05）,其精子活力和精子密度与对照组的差异不显著（P＞0.05）。日粮添加50 mg·kg^-1或100 mg·kg^-1纳米锌组公羊精浆Cu-ZnSOD活性、GPxs活性和总抗氧化能力显著高于对照组（P＜0.05）,精浆MDA含量显著低于对照组（P＜0.05）;添加150 mg·kg^-1组公羊精浆总抗氧化能力显著高于对照组（P＜0.05）,其精浆Cu-ZnSOD活性、GPxs活性和MDA含量与对照组差异不显著（P＞0.05）。免疫组化定位结果显示Cu-ZnSOD在附睾头和附睾体假复层上皮、结缔组织和附睾尾的单层柱状上皮中均检测到阳性信号,试验处理组公羊附睾中Cu-ZnSOD表达量由高到低顺序是：附睾体＞附睾头＞附睾尾;然而对照组的顺序为：附睾头＞附睾体＞附睾尾。50 mg·kg^-1或100 mg·kg^-1纳米锌组公羊附睾头和附睾体阳性信号的平均光密度显著高于对照组和150 mg·kg^-1纳米锌（P＜0.05）。精浆Cu-ZnSOD活性与精子密度、精子活力和精子质膜完整性呈正相关,与精子畸形率呈负相关。【结论】日粮添加50 mg·kg^-1或100 mg·kg^-1纳米锌可改善精液品质,提高精浆抗氧化能力,增加附睾中Cu-ZnSOD蛋白表达量。精浆Cu-ZnSOD活性可以作为检测精液品质优劣的指标在羊生产中应用。微量元素锌对精液品质影响调控的分子机理还需进一步深入研究。     

肝素和羊血清对绵羊附睾精子体外获能的影响

通过对体外受精试验检验了肝素和羊血清有绵羊附睾精子体外获能中的作用。结果表明,在获能液ＳＯＦＭ＋０．６％牛血清白蛋白（ＢＳＡ）中加入５、１５、２５、５０ＩＵ／ｍｌ肝素不能有效诱导精子获能,所得卵裂率（１６．１％,１１．２％,１４．５％,１５．８％）与不加肝素的对照组（１０．０％）相比,差异不显著;获能液ＳＯＦＭ＋２０％羊血清（ＳＳ）对精子获能效果优于ＳＯＦＭ＋０．６％ＢＳＡ＋肝素,二者卵裂率差异显