低温对玉米幼苗叶片中核酸含量和核酸酶活力的影响

耐冷性明显不同的两个玉米自交系幼苗在4℃低温处理期间,叶片中的核酸含量随处理时间延长而减少.RNA减少量比DNA明显.核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶活力随处理时间延长而增强.可溶性蛋白质含量的变化趋势是先增加,后减少.两个自交系相比,上述指标均是耐冷性弱的自交系比耐冷性强的自交系变化明显.     

芹菜不同器官、品种CELⅠ核酸酶提取的比较

随着TILLING技术的发展,发挥关键作用的芹菜CELⅠ核酸酶也得到了越来越广泛的应用。鉴于其活性直接影响突变体检测的效果,而芹菜粗提物中CELⅠ核酸酶的含量和活性因提取组织及提取程序不同而有较大变化,所以本研究分析了芹菜不同器官、品种等因素对CELⅠ核酸酶粗提物提取量的影响,并用只含有1个碱基差异的2个目的DNA片段形成的杂交链为底物对其活性进行了鉴定。结果表明:芹菜不同器官和品种间的CELⅠ核酸酶提取量存在较大差异。不同器官的榨汁率和提取量,以茎的出汁率最高,而叶片中的提取量显著高于根和茎中的提取量;在本研究所用的3个品种中,以山东地方品种马家沟芹的提取量最高,山芹次之,西芹的提取量最低;CELⅠ核酸酶的活性鉴定表明,CELⅠ核酸酶粗提物能有效切割DNA双链中的错配碱基。     

毛竹4个B-box锌指蛋白序列和基因表达特征及PeBZF4的功能

【目的】B-box锌指蛋白( BZF)在植物生长发育和应对逆境过程中发挥着重要的调控作用。强光胁迫对竹子的生长发育有着重要的影响,通过分析毛竹 BZF 基因编码蛋白的分子特征及组织表达模式,研究过量表达PeBZF4转基因植株的荧光动力学参数变化,以期为揭示竹子 BZF 基因对强光的应答与调节机制提供参考。【方法】采用同源基因比对的方法直接从 BambooGDB中获得毛竹 BZF基因同源序列,利用专用软件和在线公共平台分析基因及其编码蛋白序列,查找各种作用元件,预测蛋白功能结构域,分析蛋白的亲水性/疏水性。采用实时定量 PCR技术分析基因在不同组织中的表达情况以及强光(1200μmol·m －2 s －1)和黑暗处理后基因在叶片中的表达变化。构建 PeBZF4基因的过量表达载体,利用农杆菌介导法转化拟南芥,直接观察转基因植株表型,利用IMAGING-PAM 荧光仪测定其叶绿素荧光参数。【结果】从毛竹数据库获得4条不同的 BZF 基因同源序列,编码4个不同的锌指蛋白,分别命名为 PeBZF1,PeBZF2,PeBZF3和 PeBZF4。4个基因中均具有光应答顺式作用调控元件 ACE和 G-box,但它们所含光应答元件却有所差异,PeBZF1中有 MNF1和 Sp1,PeBZF2中有 I-box,Sp1和 boxⅡ, PeBZF3和PeBZF4中有GT1-motif,MNF1和Sp1。4个基因所编码的蛋白都具有2个B-box结构域和CHC3H2锌指结合域,属于B-box型锌指蛋白。在根、茎、叶片和叶鞘中的表达4个基因存在着明显差异,其中PeBZF1和PeBZF3在叶片中的表达丰度最高,PeBZF2和 PeBZF4在叶鞘中的表达丰度最高。强光处理后 4个基因的表达均受到抑制,且随着光照时间的延长 PeBZF2和 PeBZF3的表达呈逐渐下降趋势,而 PeBZF1和 PeBZF4的表达却在光照1 h时比0.5 h时略微上调,随后迅速下降;黑暗对 PeBZF1,PeBZF2和 PeBZF3的表达有明显抑制作用,而 PeBZF4的表达却显著上调,约是对照的3.2倍。过量表达 PeBZF4的转基因植株光系统Ⅱ的实际光合效率 Y(Ⅱ)和非光化学猝灭( NPQ)值都比野生型有不同程度的提高。【结论】毛竹中有4个不同B-box型锌指蛋白基因,其表达为组成型,强光和黑暗处理4个基因的表达变化表明它们参与了光胁迫的应答调节。过量表达 PeBZF4基因能够提高转基因植株的 Y(Ⅱ)和 NPQ值,证明 PeBZF4能够增强其热耗散能力,提高强光下的光合效率。因此,BZF 可能与竹子抵抗强光胁迫有关。     

锌指核酸酶技术在基因治疗中的应用研究进展

锌指核酸酶技术是一种新兴的基因高效靶向修饰和调控技术,目前该技术已在人类疾病的基因治疗中得到应用,通过敲除致病基因使其丧失致病性或者通过修复突变基因使基因表达正常,实现了对多种人类疾病的基因治疗。基于提高锌指核酸酶效率、特异性和降低细胞毒性等方面的研究较少的现状,特就人工锌指核酸酶介导的基因敲除和基因同源重组修复等在人类疾病基因治疗方面的应用及存在问题进行了综述,并对相关研究的开展进行了展望。     

锌指核酸酶技术在基因组定点修饰中的应用

锌指核酸酶已作为一种基因组编辑工具成功应用于多种有机体及细胞类型。它包括一个非特异的FokⅠ核酸内切酶DNA切割结构域和一个特异性的DNA结合结构域。可以在基因组定点产生双链断裂,并通过细胞对基因组DNA的自我修复途径使基因打靶效率提升几个数量级。当包含该位点同源区的外源DNA存在时发生同源重组修复,实现外源基因的定点敲入,无同源DNA存在时通过非同源末端连接途径产生基因突变。在锌指核酸酶技术出现前,基因打靶动物的生产主要是依靠ES细胞系上的同源重组技术或核移植基础上的克隆技术,但仅限于极少数物种。本文简要介绍这一技术作用原理和设计方法,以及它在疾病治疗,模式动物研究和动物生物反应器方面的最新研究进展,旨在展示锌指核酸酶技术的广阔前景。     

钠盐胁迫对小麦叶片核酸损伤和多胺积累的影响

采用室内培养、测定方法研究不同浓度的NaCl,Na2SO4和Na2CO3胁迫对小麦(Triticumaestvum)叶片H2O2、核酸代谢和多胺影响。结果表明,在钠盐胁迫下H2O2含量随着胁迫浓度的增加而增加,其中Na2CO3胁迫下H2O2含量增加最显著。核酸含量随着胁迫浓度的增加而减少,且RNA含量变化明显大于DNA,而核酸酶的活性在低浓度胁迫下升高,高浓度胁迫下降低,证实钠盐胁迫主要影响核酸的合成,其中对小麦叶片RNA的影响明显大于对DNA的影响。多胺亦随之积累,Na2CO3胁迫下多胺积累最显著,且变化量为腐胺(Put)>精胺(Spm)>亚精胺(Spd);高钠盐胁迫下多胺积累不明显,其中腐胺在200mmol·L-1下反而减少。     

巴西橡胶树HbSAP1基因克隆及表达分析

胁迫相关蛋白(Stress associated proteins,SAPs)在植物免疫应答和胁迫反应中发挥着重要作用。采用电子克隆和RT-PCR相结合的方法,从巴西橡胶树中分离胁迫相关蛋白基因Hb SAP1。结果表明:Hb SAP1基因的开放阅读框为537 bp,编码178个氨基酸。Hb SAP1蛋白预测分子量为18.87 ku,等电点为7.98,具有典型的A20和AN1锌指结构域。实时荧光定量PCR分析结果表明,Hb SAP1基因在巴西橡胶树各组织中均有表达,以茎尖中的表达量最高。同健康橡胶树相比,Hb SAP1基因在死皮橡胶树胶乳和树皮中的表达量显著升高。伤害、H2O2、乙烯利及茉莉酸甲酯处理均能使胶乳中Hb SAP1基因的表达上调。低温及PEG诱导的干旱胁迫下,Hb SAP1基因在叶片中的表达显著增强。上述结果表明,Hb SAP1基因可能在橡胶树死皮发生、非生物胁迫应答、乙烯及茉莉酸信号转导中发挥重要调控作用。     

一个水稻穗特异表达锌指蛋白基因的克隆与结构分析

利用生物信息学和RT PCR方法从水稻中克隆鉴定了一个新的具有TFⅢA型锌指结构的锌指蛋白基因,其开放阅读框为1092 bp,编码363个氨基酸残基。组织表达谱结果表明,该基因只在水稻幼穗组织中表达,在成株期的根、叶、茎以及花药中不表达,将其命名为OsZPT3 1。序列分析表明OsZPT3 1具有3个C2H2型锌指结构,在氨基酸的C端没有典型的转录抑制区域DLN box,但LXLXL的结构仍然表明OsZPT3 1可能是一个转录抑制因子。对OsZPT3 1启动子区域进行预测,结果发现3个MADS box转录因子识别位点,推测OsZPT3 1可能在MADS box转录因子的调节下,通过抑制下游基因的表达在水稻穗部器官的生长发育过程中发挥重要的调控作用。     

人工锌指蛋白文库的构建

【目的】以猪基因组为模板,扩增天然锌指,以此建立人工锌指蛋白文库,为猪基因组的定点操作及基因表达研究奠定基础。【方法】利用质粒JMB378和JMB440构建锌指文库骨架载体JMB378-ZF1-MCS,然后根据天然锌指蛋白接头序列的保守性,设计5条简并引物扩增猪基因组中的天然单锌指结构域,将其与JMB378-ZF1-MCS载体上的人工锌指ZF1中识别GGC的锌指蛋白连接,构建二锌指蛋白文库,通过酶切方式再将天然单锌指结构域插入到二锌指蛋白文库中,构建三锌指蛋白文库。测定锌指库容量及阳性率,并通过酶切和测序检测锌指库的多样性。【结果】构建了基于猪天然锌指模块的包含ZF1的三锌指蛋白文库,库容量达到1.5×106 CFU。该文库中含有一个人工锌指蛋白ZF1和2个天然型锌指蛋白,能够对基因组中所有以GGC起始的9bp靶序列进行筛选。【结论】构建了基于天然单锌指模块的三锌指蛋白文库,为构建新型锌指蛋白提供了一种可行的方法。     

木薯锌指转录因子MeDi19-1基因克隆及表达分析

【目的】克隆木薯锌指转录因子基因MeDi19-1,分析其编码蛋白特征、亚细胞定位、转录激活活性及在木薯不同组织中的表达水平,为探究MeDi19-1基因在木薯中的作用机制提供理论参考。【方法】从木薯KU50扩增MeDi19-1基因编码区（CDS）序列,利用生物信息学软件对其进行预测分析,并构建pNC-Green-SubC-MeDi19-1融合表达载体,通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞,观察荧光信号以确定蛋白的亚细胞定位情况。利用酵母系统确定其转录激活活性,并基于木薯不同组织转录组数据分析其组织表达特性。【结果】MeDi19-1基因CDS序列（OL620080）长度为618bp,共编码205个氨基酸残基,蛋白分子量为22416.79 Da,理论等电点（pI）为6.10,属于不稳定疏水蛋白,含有Di19蛋白家族典型的锌指结构域zf-Di19。MeDi19-1蛋白的二级结构中含有无规则卷曲（53.66%）、α-螺旋（40.49%）、延伸链（4.39%）和β-转角（1.46%）。MeDi19-1蛋白氨基酸序列与橡胶树（Hevea brasiliensis）Di19蛋白氨基酸序列（XP_021655585.1）相似性最高,为83.50%。MeDi19-1基因启动子元件含有脱落酸（ABA）、赤霉素和茉莉酸等激素响应元件及胁迫响应元件和光响应元件。MeDi19-1蛋白亚细胞定位于细胞膜和细胞核中,具有转录激活活性,且活性区域在C端。MeDi19-1基因在叶、叶中脉和储藏根中相对表达量较高。【结论】MeDi19-1基因属于Di19基因家族成员,具有组织表达特异性,主要在叶、叶中脉和储藏根中发挥调控作用,其编码蛋白在木薯组织中作为转录因子参与调节多项生理活动。