水稻锌指蛋白基因CRISPR/Cas9突变体的构建及突变分析

[目的]通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对水稻锌指蛋白基因(OsC3H54)进行基因编辑,筛选鉴定出其突变体植株,为深入研究OsC3H54的生物学功能提供良好材料,也为水稻锌指蛋白研究提供参考依据.[方法]通过E-CRISP在OsC3H54基因的外显子上设计靶点序列,将靶点序列连接至OsU6SK载体上,再与Cas9一起连接到pCAM-BIA1300双元载体上,获得CRISPR/Cas9重组双元载体,通过农杆菌介导将其转入日本晴水稻愈伤组织,利用潮霉素进行抗性筛选,获得突变体植株,并分析其靶点位置的碱基及编码氨基酸突变情况.[结果]在OsC3H54基因第2个外显子上找到2个符合靶点设计要求的靶点,分别为TG1:5'-CCGCCGCGGCTGCCTTTGGATAC-3'和TG2:5'-CCTTCCC CAATGGCGGGGGTGGC-3'.将OsU6SK载体和靶点序列正确连接的重组载体与Cas9一起连接至pCAMBIA1300双载体上,成功获得CRISPR/Cas9重组双元载体(pCAMBIA1300-Cas9-TG1和pCAMBIA1300-Cas9-TG2).通过农杆菌介导转入日本晴水稻,经潮霉素抗性筛选获得TG1靶点株系和TG2靶点株系,共16株CRISPR/Cas9突变体植株.CRISPR/Cas9突变体植株在靶点序列的突变位点位置附近出现套峰,表明2个株系的植株均发生碱基突变,其中Y1、Y2、Y3和Y4突变体植株均为单碱基插入突变,最终导致编码的氨基酸发生移码突变,蛋白翻译提前终止.[结论]水稻OsC3H54基因CRISPR/Cas9突变体植株的获得为进一步研究水稻锌指蛋白生物学功能提供了良好材料.     

一个锌指结合蛋白编码基因调控水稻种子萌发

【目的】致力于挖掘水稻低温萌发力(LTG)相关基因,并解析其分子作用机理,为水稻低温萌发力遗传改良和分子育种提供理论基础。【方法】利用已有的不同水稻品种低温萌发转录组测序数据筛选差异表达基因,构建目的基因的遗传转化材料,通过转基因材料的萌发试验鉴定目的基因功能。【结果】OsYIPL1编码Yippee家族锌指结合蛋白,在高LTG品种中高表达,被选作深入研究的对象。时空表达结果显示,OsYIPL1在水稻花药和幼胚等组织中高表达。通过遗传转化获得两个过表达株系OX-1、OX-2,其T₂代种子用于常温(28℃)和低温(13℃)萌发试验。当OsYIPL1表达量升高到野生型的44.5倍(OX-1)时,其种子在常温下的萌发率比野生型平均提高18.3%;当OsYIPL1表达量升高到野生型的88.9倍(OX-2)时,其种子在常温下的萌发率比野生型平均降低54.5%。低温下,过表达OsYIPL1均会降低种子的萌发力,OX-1和OX-2的低温萌发率比对照平均降低43.8%和81.5%。【结论】OsYIPL1参与调控水稻种子萌发过程,但在不同温度下的作用差异显著,其分子作用机理仍待进一步...     

一个水稻CCCH型锌指蛋白基因的表达模式分析

利用RT-PCR、生物信息学及其启动区与GUS基因的融合表达分析等方法,分析了一个水稻CCCH型锌指基因OsZF77的表达模式。OsZF77开放阅读框包含843个核苷酸,编码280个氨基酸,含有2个CCCH锌指结构域。RT-PCR分析表明该基因在水稻种子的胚乳中具有较高丰度的表达而在胚中不表达。对OsZF77上游2．5kb左右的启动子区段进行分析发现含有种子特异性表达必需的序列元件RY（CATGCATG）。进一步分析了该基因启动子区段与GUS基因融合表达载体的转基因水稻植株,结果表明GUS在种子胚乳特别是靠种皮的外围胚乳中具强表达,而在胚中检测不到GUS活性。以上结果说明该基因是一个胚乳优势表达基因。     

制备大肠杆菌菌蜕的方法比较

为进一步研究大肠杆菌菌蜕的制备技术,以pBV221、pCold IV和pETDuet1载体为基础构建了表达噬菌体E基因的溶菌质粒,并利用pETDuet1的2个多克隆位点构建了同时表达E基因和金黄色葡萄球菌核酸酶A的双表达溶菌质粒。经检测,pBV221-E/DH_(5α)组和pCold-E/BL_(21)组的裂解效率最高,但pCold-E/BL_(21)组的裂解起始时间晚于其他几组。诱导剂的浓度对pETDuet1-E-SNA/BL_(21)(DE3)的裂解效率有较大影响。电泳结果显示,随着E基因的表达,细菌DNA逸出膜外,同时金黄色葡萄球菌核酸酶A将DNA降解为250 bp以下的小片段。除pBV221-E/BL_(21)组外,β-丙内酯可实现对其他试验组菌蜕的完全灭活。电镜观察发现,几组菌蜕在结构上并无明显差别。与对照菌相比,菌蜕结构完整,电子密度低且不均匀,细胞膜有不同程度的皱缩。     

果树自交不亲和机制研究进展

苹果、梨等果树均具有典型的配子体型自交不亲和性,该性状是由单一位点(S-locus)上的分别控制花柱和花粉特异性的复等位基因(S-allele)所决定的.其中,控制花柱自交不亲和性的决定因子被确定为S-RNase,而花粉决定因子则可能是由SLF(S-locus F-box)/SFB(S-haplotype-specif...     

人工锌指蛋白随机库的构建及其在锌指核酸酶筛选中的应用

利用开源式(Oligomerized pool engineering,OPEN)方法筛选具有较高特异性和亲和性的锌指蛋白(Zinc finger protein,ZFP).以已知三锌指蛋白为框架,使单个锌指关键位点氨基酸编码序列产生随机突变,构建3个人工锌指蛋白随机库,建立和完善应用人工锌指蛋白随机库筛选特异性锌指蛋白的技术平台.以人DYRK1A基因为例,测试和验证该技术平台的可行性和效率,分别获得对DYRK1A基因靶序列中左侧和右侧位点具有较高亲和性的50个三锌指蛋白;然后将得到的锌指蛋白与非限制性核酸内切酶FokⅠ连接,构建DYRK1A锌指核酸酶(Zinc finger nucleases,ZFN),应用酵母验证系统测试DYRK1A锌指核酸酶的活性,结果表明,90％的组装锌指核酸酶能够在靶位点进行切割.     

靶向绵羊MSTN基因的锌指核酸酶腺病毒表达载体的构建及活性验证

旨在构建并包装打靶绵羊MSTN基因的位点特异性锌指核酸酶腺病毒表达载体,以借助腺病毒的高转染效率和非整合性以及锌指核酸酶的高效性和特异性实现对绵羊MSTN基因的敲除。本研究利用PCR扩增T2A序列和锌指核酸酶异源二聚体序列,测序鉴定后依次克隆至pAdTrack-CMV,得到pAdTrack-ZFNL-T2A-ZFNR穿梭载体,将之与腺病毒骨架载体pAdEasy-1共转染至BJ5183菌株进行同源重组,以构建pAdEasy-ZFNL-T2A-ZFNR表达载体。然后用上述表达载体转染HEK293细胞进行重组腺病毒的包装,将PCR鉴定阳性的病毒进行扩增并测定病毒滴度。侵染绵羊胎儿成纤维细胞检测重组腺病毒对靶细胞的侵染能力,并用Western blot方法检测绵羊胎儿成纤维细胞中ZFN的表达,进而在细胞水平验证ZFN的活性。结果,包装得到的锌指核酸酶重组腺病毒能够高效侵染绵羊胎儿成纤维细胞并表达ZFN,腺病毒介导的ZFN可识别并切割绵羊MSTN基因。本研究成功获得靶向识别并切割绵羊MSTN基因的锌指核酸酶重组腺病毒。     

芹菜不同器官、品种CELⅠ核酸酶提取的比较

随着TILLING技术的发展,发挥关键作用的芹菜CELⅠ核酸酶也得到了越来越广泛的应用。鉴于其活性直接影响突变体检测的效果,而芹菜粗提物中CELⅠ核酸酶的含量和活性因提取组织及提取程序不同而有较大变化,所以本研究分析了芹菜不同器官、品种等因素对CELⅠ核酸酶粗提物提取量的影响,并用只含有1个碱基差异的2个目的DNA片段形成的杂交链为底物对其活性进行了鉴定。结果表明:芹菜不同器官和品种间的CELⅠ核酸酶提取量存在较大差异。不同器官的榨汁率和提取量,以茎的出汁率最高,而叶片中的提取量显著高于根和茎中的提取量;在本研究所用的3个品种中,以山东地方品种马家沟芹的提取量最高,山芹次之,西芹的提取量最低;CELⅠ核酸酶的活性鉴定表明,CELⅠ核酸酶粗提物能有效切割DNA双链中的错配碱基。     

巴西橡胶树HbSAP1基因克隆及表达分析

胁迫相关蛋白(Stress associated proteins,SAPs)在植物免疫应答和胁迫反应中发挥着重要作用。采用电子克隆和RT-PCR相结合的方法,从巴西橡胶树中分离胁迫相关蛋白基因Hb SAP1。结果表明:Hb SAP1基因的开放阅读框为537 bp,编码178个氨基酸。Hb SAP1蛋白预测分子量为18.87 ku,等电点为7.98,具有典型的A20和AN1锌指结构域。实时荧光定量PCR分析结果表明,Hb SAP1基因在巴西橡胶树各组织中均有表达,以茎尖中的表达量最高。同健康橡胶树相比,Hb SAP1基因在死皮橡胶树胶乳和树皮中的表达量显著升高。伤害、H2O2、乙烯利及茉莉酸甲酯处理均能使胶乳中Hb SAP1基因的表达上调。低温及PEG诱导的干旱胁迫下,Hb SAP1基因在叶片中的表达显著增强。上述结果表明,Hb SAP1基因可能在橡胶树死皮发生、非生物胁迫应答、乙烯及茉莉酸信号转导中发挥重要调控作用。