大豆锌指转录因子GmDi19-5对高温的响应及互作蛋白的筛选

【目的】高温胁迫已经成为威胁作物生长发育的主要非生物胁迫因素之一,转录因子在植物非生物胁迫响应中起着重要作用。通过对大豆锌指转录因子基因Gm Di19-5在高温胁迫下的响应和功能鉴定,以及利用酵母双杂交技术从大豆c DNA文库筛选与其互作的候选蛋白,研究Gm Di19-5对高温胁迫的响应机制。【方法】以大豆c DNA为模板,利用实时荧光定量PCR检测Gm Di19-5在高温处理不同时间段的表达模式;通过Plant CARE和PLACE数据库预测Gm Di19-5启动子元件,并对Gm Di19-5启动子转基因拟南芥在高温处理下进行的组织化学染色,分析Gm Di19-5启动子在高温胁迫下的活性;构建p GBKT7-Gm Di19-5诱饵载体,验证自激活活性;利用酵母双杂交技术,以p GBKT7-Gm Di19-5为诱饵筛选大豆c DNA文库,筛选与其互作的候选蛋白;进一步用酵母双杂交系统验证Gm Di19-5与候选蛋白的互作;利用实时荧光定量PCR检测候选蛋白基因在对高温处理的响应情况;构建融合表达载体,用GFP-Gm Di19-5融合表达载体转化拟南芥原生质体,检测Gm Di19-5蛋白的亚细胞定位情况。【结果】实时荧光定量PCR结果显示,Gm Di19-5在高温胁迫下上调表达;启动子元件分析表明,Gm Di19-5包含多种与胁迫应答相关的顺式作用元件,包括热响应元件HSE;组织化学染色分析发现,经高温处理后,过表达拟南芥幼苗的地上部分和地下部分均有报告基因的表达;亚细胞定位结果表明,Gm Di19-5蛋白定位于拟南芥原生质体的细胞核中;通过酵母双杂交技术筛选到了与Gm Di19-5互作的候选蛋白,试验进一步验证了Gm Di19-5与Gm Dna J在酵母细胞中互作;另外,实时荧光定量PCR结果显示,互作蛋白基因Gm Dna J受高温胁迫诱导表达。【结论】Gm Di19-5受高温诱导表达,Gm Di19-5可能与Gm Dna J互作,表明Gm Di19-5功能的发挥可能需要Gm Dna J的参与。     

甘蓝锌指蛋白转录因子BoC2H2的克隆、定位与表达分析

C2H2型锌指蛋白是植物中最重要的转录调节子之一, 主要调控植物的生长发育和胁迫应答反应。本研究通过分析自交不亲和甘蓝未授粉, 自花授粉15、30和60 min, 异花授粉15、30和60 min柱头转录组数据, 筛选到一个自花授粉诱导上调表达的C2H2型锌指蛋白基因, 命名为BoC2H2。BoC2H2开放阅读框756 bp, 编码251个氨基酸残基, 蛋白分子量为26.7 kDa, 等电点为4.62, 是一种亲水性蛋白, 不含信号肽和跨膜域, 含有C2H2型锌指蛋白家族高度保守的ZnF_C2H2结构域。BoC2H2起始密码子上游2000 bp的核苷酸序列中含有光响应、昼夜节律、茉莉酸响应、防御和应激反应等多种顺式作用元件。通过原生质体亚细胞定位和瞬时浸染烟草, 发现BoC2H2蛋白在细胞核和细胞质中表达。BoC2H2在下胚轴、叶片和花中均有表达, 柱头中的表达量随发育时间而变化, 开花当天后表达量降低。荧光定量PCR结果显示, BoC2H2在自花授粉和异花授粉0~60 min的表达量变化趋势与转录组分析结果基本一致。综上所述, 甘蓝BoC2H2属于C2H2型锌指蛋白家族, 可能参与了柱头响应花粉刺激的分子过程, 这有利于揭示BoC2H2在甘蓝自交不亲和过程中的作用机制, 为研究C2H2型转录因子在甘蓝自交不亲和过程中的调控机制提供依据。     

长枝修剪对NJC19黄桃树体生长及果实品质的影响

连续2年对NJC19黄桃进行长枝修剪试验,对树体生长和果实品质进行测定分析。结果表明,与传统的短枝修剪技术相比,经过长枝修剪后的树体叶面积增大,净光合速率提高;徒长枝比例降低,优质果枝率增加;一年生枝条的可溶性糖和淀粉含量均提高,树体营养状况得到改善;果实的可溶性固形物含量和可滴定酸含量均得到提高,果实着色更加均匀。     

棉花C3HC4型RING锌指蛋白基因GhSIZ1克隆及表达分析

植物抗逆分子机制非常复杂,克隆并鉴定新的逆境相关基因,有助于解析植物抗逆机理。C3HC4型锌指蛋白在植物生长发育和抵抗非生物胁迫中发挥重要作用。本研究从陆地棉‘Y1169’中克隆了1个C3HC4型锌指蛋白的基因GhSIZ1 (XM＿041085878.1),并分析GhSIZ1对干旱、盐胁迫和脱落酸的转录响应。序列分析表明该基因cDNA全长3 389 bp,含有1个2 613 bp的开放阅读框,利用生物信息学分析了棉花GhSIZ1基因的理化性质及其结构功能域,结果显示棉花GhSIZ1基因编码870个氨基酸,为亲水性蛋白,预测分子量约为279.39 k D,理论等电点为4.86,脂肪指数为29.06。GhSIZ1中含有1个C3HC4型RING锌指结构域。系统进化树分析表明Gh SIZ1与达尔文棉(Gossypium darwinii) TYG＿87958.1、海岛棉(Gossypium barbadense)KAB＿2050370.1和夏威夷棉(Gossypium tomentosum) TYH＿93561.1等植物的蛋白质相似性较高,与达尔文棉TYG＿87958.1处于同一进化枝上,亲缘...     

锌指蛋白核酸酶技术

2009年4月29日在著名的杂志上在线发表了"使用锌指蛋白核酸酶"(ZFN)加速经济作物玉米的精确性状堆叠"及"利用锌指蛋白核酸酶改变模式植物烟草的单个基因的序列,使其具有抗除草剂特性"的两项成果.     

锌与锌指蛋白对机体贫血的影响

锌参与动物体内300余种酶和功能蛋白的组成,它不仅影响营养物质、遗传物质的代谢,同时与许多活性物质有关。锌指蛋白的发现使人们认识到锌以锌指蛋白的方式调控着机体的生命活动,锌指蛋白是基因调控蛋白中最重要的蛋白。本文综述了锌与锌指蛋白的关系以及锌指蛋白对机体贫血的影响,以深入了解机体贫血的机制。     

一个水稻CCCH型锌指蛋白基因的表达模式分析

利用RT-PCR、生物信息学及其启动区与GUS基因的融合表达分析等方法,分析了一个水稻CCCH型锌指基因OsZF77的表达模式。OsZF77开放阅读框包含843个核苷酸,编码280个氨基酸,含有2个CCCH锌指结构域。RT-PCR分析表明该基因在水稻种子的胚乳中具有较高丰度的表达而在胚中不表达。对OsZF77上游2．5kb左右的启动子区段进行分析发现含有种子特异性表达必需的序列元件RY（CATGCATG）。进一步分析了该基因启动子区段与GUS基因融合表达载体的转基因水稻植株,结果表明GUS在种子胚乳特别是靠种皮的外围胚乳中具强表达,而在胚中检测不到GUS活性。以上结果说明该基因是一个胚乳优势表达基因。     

水稻锌指蛋白基因CRISPR/Cas9突变体的构建及突变分析

[目的]通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对水稻锌指蛋白基因(OsC3H54)进行基因编辑,筛选鉴定出其突变体植株,为深入研究OsC3H54的生物学功能提供良好材料,也为水稻锌指蛋白研究提供参考依据.[方法]通过E-CRISP在OsC3H54基因的外显子上设计靶点序列,将靶点序列连接至OsU6SK载体上,再与Cas9一起连接到pCAM-BIA1300双元载体上,获得CRISPR/Cas9重组双元载体,通过农杆菌介导将其转入日本晴水稻愈伤组织,利用潮霉素进行抗性筛选,获得突变体植株,并分析其靶点位置的碱基及编码氨基酸突变情况.[结果]在OsC3H54基因第2个外显子上找到2个符合靶点设计要求的靶点,分别为TG1:5'-CCGCCGCGGCTGCCTTTGGATAC-3'和TG2:5'-CCTTCCC CAATGGCGGGGGTGGC-3'.将OsU6SK载体和靶点序列正确连接的重组载体与Cas9一起连接至pCAMBIA1300双载体上,成功获得CRISPR/Cas9重组双元载体(pCAMBIA1300-Cas9-TG1和pCAMBIA1300-Cas9-TG2).通过农杆菌介导转入日本晴水稻,经潮霉素抗性筛选获得TG1靶点株系和TG2靶点株系,共16株CRISPR/Cas9突变体植株.CRISPR/Cas9突变体植株在靶点序列的突变位点位置附近出现套峰,表明2个株系的植株均发生碱基突变,其中Y1、Y2、Y3和Y4突变体植株均为单碱基插入突变,最终导致编码的氨基酸发生移码突变,蛋白翻译提前终止.[结论]水稻OsC3H54基因CRISPR/Cas9突变体植株的获得为进一步研究水稻锌指蛋白生物学功能提供了良好材料.     

制备大肠杆菌菌蜕的方法比较

为进一步研究大肠杆菌菌蜕的制备技术,以pBV221、pCold IV和pETDuet1载体为基础构建了表达噬菌体E基因的溶菌质粒,并利用pETDuet1的2个多克隆位点构建了同时表达E基因和金黄色葡萄球菌核酸酶A的双表达溶菌质粒。经检测,pBV221-E/DH_(5α)组和pCold-E/BL_(21)组的裂解效率最高,但pCold-E/BL_(21)组的裂解起始时间晚于其他几组。诱导剂的浓度对pETDuet1-E-SNA/BL_(21)(DE3)的裂解效率有较大影响。电泳结果显示,随着E基因的表达,细菌DNA逸出膜外,同时金黄色葡萄球菌核酸酶A将DNA降解为250 bp以下的小片段。除pBV221-E/BL_(21)组外,β-丙内酯可实现对其他试验组菌蜕的完全灭活。电镜观察发现,几组菌蜕在结构上并无明显差别。与对照菌相比,菌蜕结构完整,电子密度低且不均匀,细胞膜有不同程度的皱缩。     

矮牵牛冷响应锌指蛋白基因PhTZF1的分离与表达分析

利用矮牵牛基因表达谱芯片筛选出应答低温胁迫的关键基因,从中发现1个CCCH型的锌指蛋白基因PhTZF1。通过RT-PCR分离获得该基因的cDNA全长为2 085bp,预测其编码694个氨基酸,含有2个CCCH型锌指蛋白保守结构域。系统进化树分析发现,PhTZF1与拟南芥AtSZF1相似度最高。利用半定量RT-PCR检测其在根、茎、叶和花中的表达特性发现,正常生长条件下该基因在各组织中的表达都较弱;利用实时定量PCR检测其在低温、干旱、ABA、MeJA、高盐和高渗胁迫处理下的表达情况发现,PhTZF1表现出不同程度的上调,其中对低温胁迫最为敏感且上调倍数最高,初步推测该基因与矮牵牛应答低温、干旱等非生物逆境相关。