绞股蓝核糖体失活蛋白的分离、克隆与表达

核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein,RIP)具有抗肿瘤和抗病毒等医用价值,以及抗植物病毒和病原真菌等农用价值.它是一种多活性的物质,不同RIP具有各自独特的功能,其潜在活性还在不断发现之中.葫芦科(Cucurbitaceae)植物大多药食同源,其中蕴涵着极其多样的RIP,但多数已知的RIP其基因尚未被克隆,而目前仍无一套快速筛选RIP新基因的方法.葫芦科中的绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)具有抗癌和抗衰老等特殊功效,其中的皂甙和黄酮成分的研究已有大量报道,但其活性蛋白成分未见报道.为此,本研究开展绞股蓝RIP的分离纯化、基因克隆、原核表达以及转基因植物研究.率先对绞股蓝活性蛋白成分进行研究,从中分离到一种新的核糖体失活蛋白(绞股蓝毒蛋白,Gynostemmin).它具有很高的抗TMV活性.其分子量约为27 kDa.测得其N-端19个氨基酸序列:DINFSLAGADGQTYNTFIA,与其它植物RIP的同源性为10%-73%,与葫芦科RIP的同源性为37%-73%.根据葫芦科RIP上、下游两段高度保守的氨基酸序列设计简并引物对LY1/LY2,对基因组DNA进行PCR扩增,首次建立了RIP新基因快速筛选体系.从冬瓜和南瓜中分别获得了1个和5个RIP新基因,长度为408 bp,编码136 aa,与其它葫芦科RIP对应区段的同源性约为35%-85%.比较发现,19个葫芦科RIP的LY1/LY2区段上完全相同的氨基酸有29个,其中7个在其它科属来源的RIP中也完全保守,包括构成活性中心的3个残基E160、R163和W192.根据LY1/LY2区段同源性构建的系统进化树表明,葫芦科RIP之间的进化关系与其来源植物间的亲源关系大体一致.通过DNA片段克隆、RACE扩增、cDNA克隆和DNA克隆,从绞股蓝中分离了13个RIP基因,其中10个为cDNA序列,3个是DNA序列(GP609、DNA-750和DNA-8001).它们之间在碱基水平和氨基酸水平上的同源性都很高,可根据序列上发生缺失的有无及其类型将其分为4组:组1,发生6 bp缺失(535 GAAAAC 540,与574-579间的序列完全一样),包括GynostemminII、GP609和CX8405A,编码275 aa;组2,缺失87 bp(122-208),包括DNA-750和CX820,编码248 aa;组3,包括5RACE和DNA-8001,不发生组2的87 bp缺失,但因其序列较短,无法确认是否具备组1的6 bp缺失;组4,包括GynostemminI、III、IV、V以及EMUZW和RHXJB,既无87 bp缺失也不发生6 bp缺失,编码277 aa.其中GP609与其它葫芦科RIP的LY1/LY2区段的同源性,碱基水平为47%-61%,氨基酸水平为37%-49%.5RACE中包含了由23 aa组成的信号肽“MRVARFCTVVAILLYFGFHIAEC“,同时包含有5UTR序列,其中含有kozak序列“AAAAAA“.对绞股蓝RIP基因家族及其编码氨基酸进行的比较分析发现,绞股蓝RIP前体成熟过程中可能发生C-末端切除,并因此造成等电点从弱酸性跃迁至强碱性,这种现象以前未见报道.分析结果进一步支持了RIP基因无内含子的观点.5个含有3UTR的成员中,GynostemminI 比另外4个多了两个小的茎环结构和一富含AU的不稳定子元件ARE(AU-rich element),其mRNA的稳定性可能因此受到影响.运用生物信息学软件对绞股蓝RIP前体进行碱基组成和密码子偏倚性、氨基酸组成特征、功能位点、亚细胞定位、跨膜结构、核酸结合基序以及空间结构等方面的分析.分别将GP609和RHXJB转入pGEX-2T融合表达载体,在大肠杆菌DH5α菌株中实现融合表达.将DNA-8001连接到pET-5a表达载体上,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中实现天然表达,表达产物对TMV的抑制效果很差,其原因可能是C-末端延伸序列的存在抑制了抗TMV活性的发挥.分别构建了含有GP609和EMUZW的pEmu-mcs-N植物表达载体,同时构建了含有RHXJB的pKYLX71∶35S2植物表达载体(ZW-pK).采用三亲交配法将ZW-pK转入土壤农杆菌LBA4404中,用于转化烟草品种K-326,分子鉴定表明绞股蓝RIP基因已经整合到再生烟苗的基因组中并发生了转录.重点讨论了绞股蓝RIP的应用前景、RIP基因的内含子、以及RIP的C-末端及其延伸序列的修饰和功能等方面的问题.研究结果为绞股蓝RIP的开发利用奠定了坚实基础,并对探讨其酶学活性、生理功能以及抗病毒机理等RIP研究的难点和热点问题具有一定的指导意义.     

玉米转基因在分子农业领域的研究进展

植物转基因技术开辟了作物遗传改良的新途径。近年来,随着植物反应器技术的多元化发展以及日趋成熟,以玉米为分子工厂合成一些高价值产品成为研究热点。笔者就以玉米为植物反应器,用其生产糖类、必需氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素、微量元素、生物酶、疫苗、抗体等各种高价值分子代谢物进行了综述,以期为中国分子农业领域的研究与应用提供参考。     

2004年第一批进口农业转基因生物安全审批情况

自2002年3月20日《农业转基因生物安全管理条例》的三个配套规章实施后，农业部农业转基因生物安全管理办公室收到美国孟山都、杜邦及陶氏益农、德国拜耳、瑞士先正达等5家境外研发公司18份进口用作加工原料的农业转基因生物安全证书申请，其中转基因大豆1份、转基因玉米8份、转基因油菜7份、转基因棉花2份，涉及的产地国主要有美国、加拿大、巴西和阿根廷。     

苹果转基因四倍体株系问世

山东省泰安市果树育苗专业户韩勇的苗圃里，生长着两畦世界上仅有的苹果苗——载有三种抗病基因的苹果植株。初冬的阳光下，幼苗的绿装尚未褪掉，一畦转基因植株与普通苹果苗没有区别，而另一畦四倍体转基因植株叶片厚实、枝条粗壮。我国10位生物技术和果树专家鉴定认为，山东果树研究所完成的这项研究在苹果抗病遗传转化体系上居国际领先水平。     

转基因抗虫棉纯度的幼苗鉴定方法研究

根据卡那霉素标记基因与Bt抗虫基因紧密连锁的关系．试验研究了利用卡那霉素溶液快速鉴定携带转Bt基因抗虫棉纯度的4种方法．其方法具有简便、快捷、有效的特点，可在转基因抗虫棉杂交后代选择和繁种保纯中应用，同时也为种子企业抗虫棉纯度检验提供了一种新方法。     

草甘膦水剂及其可用作创新品牌的新型助剂

草甘膦在全球销量最大的50种农药中，稳居第一。随着农业高新技术的普及发展，草甘膦的应用区域进一步扩大。正在向免耕稻田、油菜田、高杆作物、转基因大豆、棉花、玉米等作物地推广应用，使用量逐年递增。现阶段，较难出现可取代它的新产品。因此，草甘膦的市场很广，而且稳定。例如：两广、海南市场，每年草甘膦水剂销量超过3万吨。     

转基因棉花培育技术平台在武汉建成

日前，华中农业大学教授杨业华主持的一科研项目通过鉴定，这意味着我国新型转基因棉花培育技术平台初步建成。专家们认为，该技术平台具有较强操作性，应用前景看好，其中直接转化幼芽成苗的方法达到国际先进水平。     

生物技术在大白菜育种上的应用

综述了生物技术在大白菜育种上的应用,即以单倍体培养和组织培养为核心的细胞工程技术、转基因和DNA分子标记技术在培育抗病、抗虫、抗逆、抗除草剂、改良品质的大白菜品种上的研究进展.     

巴基斯坦转基因作物发展概况

近年来,发展中国家在转基因技术与商业化发展上取得了巨大进展。巴基斯坦是同中国有着深厚友谊的国家,是“一带一路”政策亚欧非大陆的重要一站。本文介绍了巴基斯坦转基因技术发展现状及转基因商业化情况,研究其管理框架及政策变化等,分析其在政策、监管、知识产权、消费者认知度等方面存在的问题。研究结果对中国转基因政策的制定具有借鉴意义。