核盘菌多聚半乳糖醛酸酶基因克隆及诱饵蛋白表达载体构建

真菌多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)能够特异性识别真菌分泌的降解植物细胞壁的主要物质多聚半乳糖醛酸酶(PG)并抑制其活性.目前,酵母双杂交技术是快速、有效获取植物PGIP的主要途径,而其前提是要获得真菌PG的酵母诱饵载体.本研究以核盘菌的PG cDNA为模板,经PCR扩增获得1 125 bp片断,进一步将其克隆到pEASY-T1载体上.以克隆了目的基因的pEASY-T1质粒为模板,用含NdeⅠ和SalⅠ位点的引物对PG-F2/PG-R2扩增获得1 125 bp大小的目的片段,将其连接到pEASY-T1上生成pEASY-PG.用NdeⅠ和SalⅠ双酶切pEASY-PG,回收1 125 bp片段并连接到诱饵载体pGBKT7相应的酶切位点上,转化大肠杆菌菌株DH5α.在含有卡那青霉素的LB平板上筛选获得重组质粒.经NdeⅠ和SalⅠ双酶切后获得预期的1 125 bp DNA片段,表明诱饵蛋白载体pGBKT7-PG6构建成功.应用醋酸锂介导法将pGBKT7-PG6转化酵母菌株Y187,经激活培养基上培养检测,未发现蓝色菌落,表明酵母转化子自身不具有自激活功能,可用于大规模筛选经核盘菌诱导的cDNA表达文库.     

BmNPV DNA解旋酶基因酵母双杂交诱饵载体的构建

为了筛选家蚕对BmNPV DNA解旋酶的受体基因,根据GenBank公布的BmNPV (T3株)的序列,设计引物对其DNA解旋酶基因的核心结构域进行PCR扩增,成功克隆该基因并利用双酶切亚克隆至酵母双杂交诱饵载体PGBKT7.实验证明重组诱饵载体不能自激活,可以作为诱饵进行蛋白结合试验.     

橡胶树14-3-3蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活和毒性检测

以克隆到的3个编码橡胶树14-3-3蛋白的基因HbGF14a、HbGF14b、HbGF14c和为基础,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-HbGF14a、pGBKT7-HbGF14b、pGBKT7-HbGF14c,并对其进行自激活和毒性实验鉴定.自激活实验结果表明,3个诱饵载体没有自激活性;毒性实验结果表明,pGBKT...     

Lescpth5诱饵载体的构建及其自激活作用的检测

[目的]构建诱饵载体pGBKT7-Lescpth5,并检测其转录自激活活性及对酵母细胞的毒性。[方法]采用PCR技术扩增Lescpth5基因,连接到诱饵载体pGBKT7上,转化重组载体于酵母感受态细胞AH109中,在营养缺陷型培养基上进行自激活检测和毒性检测。[结果]酶切和测序鉴定结果显示诱饵载体pGBKT7-Lescpth5构建成功,读码框正确。自激活检测结果和毒性检测结果显示诱饵载体对酵母菌株AH109没有转录激活活性,对酵母菌也无毒害作用。[结论]成功构建的诱饵载体可以用于酵母双杂交系统中,为下一步的cD-NA文库筛选奠定基础。     

传染性法氏囊病病毒VP4酵母双杂交诱饵载体的构建及互作宿主细胞蛋白的筛选

VP4蛋白(viral protein 4)是传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)编码的一种重要非结构蛋白,具有蛋白水解酶活性,剪切多聚蛋白pVP2-VP4-VP3释放出pVP2、VP4、VP3,对病毒蛋白成熟具有重要的作用。为了研究VP4蛋白与宿主细胞的相互作用,本研究将IBDV VP4基因克隆入pGBKT7,构建诱饵载体pGBGtVP4,自激活试验证明其无自激活活性,对酵母细胞没有毒性。运用酵母双杂交技术,从鸡胚成纤维细胞(CEF)文库中筛选VP4的互作蛋白,经初筛、测序和回转验证,获得22个候选互作宿主细胞蛋白,为深入研究IBDV VP4与宿主互作的效应和机制奠定了基础。     

玉米ZmMPK5酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活作用检测

玉米中ZmMPK5参与了ABA诱导的抗氧化防护从而增强了植物对干旱、盐渍以及氧化胁迫的忍受能力,然而截至目前对其潜在的分子机制却知之甚少。为构建玉米ZmMPK5酵母双杂交诱饵表达载体,并检测其在宿主酵母菌MaV203中的自激活活性和毒性,利用gateway技术,以实验室保存的重组质粒pMD19T-ZmMPK5为模板,扩增得到带有attB位点的ZmMPK5基因的ORF片段,通过BP重组反应和LR重组反应,最终将该片段构建到诱饵表达空载体pDEST32上,PCR及测序鉴定结果表明,成功构建了阅读框方向和序列均正确的重组诱饵载体pDEST32-ZmMPK5。用PEG/LiAc法将重组诱饵质粒pDEST32-ZmMPK5转化酵母菌株MaV203感受态细胞,通过缺陷型平板表型分析以及X-gal分析实验检测诱饵载体表达的蛋白对宿主细胞是否具有毒性和自激活作用。最终结果表明构建的诱饵载体对宿主酵母菌MaV203既无毒性也无自激活活性,可用于后续研究,为进一步利用酵母双杂交方法从玉米cDNA文库中筛选与ZmMPK5相互作用蛋白奠定了基础。     

禽呼肠孤病毒σA基因酵母双杂交诱饵载体的构建与鉴定

为了筛选与禽呼孤病毒σA基因相互作用的宿主蛋白,本试验应用酵母双杂交技术构建禽呼孤病毒σA基因的诱饵载体pGBKT7-σA。从禽呼肠孤病毒S1133标准毒株抽提RNA,采用RT-PCR方法扩增得到σA基因片段,将其连接到诱饵载体pGBKT7上,把通过测序的重组诱饵载体命名为pGBKT7-σA。将重组诱饵载体转化酿酒酵母Y2HGold后,把不同浓度的诱饵载体转化液涂布在营养缺陷型培养基上,观察该重组诱饵载体在酵母细胞中有无毒性作用和自激活现象。结果显示,酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-σA构建成功,且对酿酒酵母无毒性和自激活现象。本研究为进一步利用酵母双杂交技术筛选与σA蛋白互作的宿主蛋白奠定了基础。     

用糖,盐诱饵诱捕罗非鱼

1990年10月25日至12月6日,我们用湖北省安陆市种禽场的20亩精养鱼池,进行用糖、盐作诱饵诱捕罗非鱼试验,取得较好效果。试验情况如下: 一、条件与方法安陆市种禽场在安陆市水产局的指导下,于1990年春新挖精养鱼池20亩,水深3米。3月底,投放鲢、鳙、鲤、鲫、鳊鱼种2356公斤,到4月27日又投放尼罗罗非鱼种5400尾,92公斤,     

引诱剂对两种外来白蚁的引诱作用

利用白蚁喜食的植物和添加剂等配制了4种白蚁诱饵并在进口木材上进行了诱捕试验，筛选出了效果较好的2种配方。并对其在木材白蚁检疫中的应用进行了探讨。     

白蚁诱饵剂成型工艺的研究

我国在 2 0世纪 70年代后期开始研制毒饵来诱杀白蚁 ,同时对毒饵的型式也进行了一定的研究 (江西永修县林业科学研究所 ,1979)。 1985年 ,原中国白蚁防治科技协作中心 ,协调、组织地方各级白蚁防治研究所共同研制出了银耳真菌腐木屑胶冻剂、蜂粉膏剂、纸袋粉剂和纸块 (管 )剂 (黄远达 ,2 0 0 1)。林树青 (1993)在研制中草药诱饵剂的过程中 ,进行了诱饵剂包装材料的筛选 ,并把中草药诱饵剂制成了诱饵包。罗均泽等(1988)、何复梅等 (1997)和佘春仁等 (1999)利用白蚁踪迹信息素及其类似物与灭蚁灵等药剂混合分别制成了诱杀包、诱杀块等型诱饵。…