花药特异嵌合启动子的构建及雄性不育转基因拟南芥的获得

为了克服TA29／Barnase转基因雄性不育植物的温度敏感性，在TA29启动子上游串联了CaMV35 S启动子，同时在CaMV35 S启动子上游串联一个调节序列antherbox，构建成嵌合启动子antherbox-CaMV35 S-pTA29。该启动元件调控的GUS基因瞬间表达实验表明它是花药颈毡层特异的启动子。这个启动元件及其调控下的barnase基因构建植物表达载体转化，拟南芥菜，获得了雄性不育的转基因植株。     

箭筈豌豆AGAMOUS同源基因及其启动子的克隆和分析

AGAMOUS(AG)是参与植物雌蕊和雄蕊发育调控的最重要花器官同源基因之一。通过TAIL-PCR、RACE和RT-PCR技术相结合,获得了箭筈豌豆花器官同源基因VsAG(VsAGAMOUS)及其上游调控序列。该基因DNA序列总长3 158 bp,CDS区域735 bp,编码含有244个氨基酸残基的蛋白产物。序列在氨基酸水平上与近缘植物豌豆PsAG基因序列一致性达98%,与拟南芥AtAG基因一致性为68%。将该基因在GenBank上注册,登录号为JF313850。生物信息学分析表明,VsAG基因第2内含子区域含有丰富的转录调控元件,在种类和功能分化上与基因上游调控序列表现出相似特征。这一结果暗示了第2内含子对豆科植物AG基因表达调控的重要作用,并为通过基因工程方法创造箭筈豌豆优良育种材料奠定了基础。     

小麦穗发芽抗性相关Vp1基因启动子的分离及功能验证

成熟期穗发芽严重影响小麦产量和品质。Vp1是调节胚发育, 促进胚成熟和休眠的重要转录因子, 对小麦种子休眠和穗发芽抗性具有重要作用。本研究分离了普通小麦B基因组Vp1基因的启动子, 生物信息学预测结果表明, 其含有9个脱落酸响应元件ABRE、2个DREB和6个MYB干旱响应元件、3个赤霉素响应元件GARE、1个水杨酸响应元件TCA-E、2个茉莉酸甲酯响应元件TGACG-motif、4个SKn-1和1个RYREPE胚乳特异表达元件。采用5′端缺失的方法, 构建了系列含Vp1启动子不同区段融合GUS报告基因的瞬时表达载体和植物表达载体。通过基因枪转化小麦愈伤组织, 瞬时表达结果显示, Vp1启动子在无诱导的情况下不能启动GUS基因表达, 在低温、ABA、GA、PEG和NaCl诱导后可以启动GUS基因表达, 表现诱导表达特性, 且其诱导表达强度随启动子缺失片段长度变短而减弱。利用Gateway方法成功构建了6个启动子各缺失片段类型的植物表达载体, 并通过农杆菌介导转化四倍体小麦Stewart, 获得转基因植株。该启动子可有效启动GUS基因在转基因植株的花药、糊粉层、穗轴及根中表达, 其他组织中没有表达。当启动子片段大于660 bp时, 外源ABA可诱导启动子启动GUS基因在转基因植株茎节中的表达。     

陆地棉异质型ACCase基因的种子特异表达载体构建与遗传转化

异质型ACCase催化乙酞CoA形成丙二酞辅酶A是植物脂肪酸合成途径中的第一个关键的步骤,也是限速步骤:植物体内过量表达ACCase能够增加脂肪酸合成的底物,有可能导致植株种子含油量的增加.本实验采用GUS基因瞬时表达检测棉花愈伤组织中种子特异性表达启动子AGP的活性;利用RT-PCR扩增,克隆了陆地棉异质型ACCas...     

诸葛菜基因启动子的分离

利用启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ２首次从诸葛菜总ＤＮＡ中克隆了７个具有启动功能的ＤＮＡ片段，转化Ｅ．ｃｏｌｉ表明最高卡那霉素（ｋｎａ）抗性为１４０μｇ／ｍｌ，最低为２０μｇ／ｍｌ。含启动子片段的７个重组质粒子分别命名为ｐＳＵＰＺ１－７，Ｓｏｕｔｈｒｅｎ印迹表明ｐＳＵＰＺ６对Ｋｎａ的抗性功能来源于诸葛菜的１０ｋｂ，５ｋｂ和３．９ｋｂ片段。     

百脉根LjIPT3启动子的克隆及表达载体的构建

[目的]为深入研究LjIPT3的表达调控和功能奠定基础。[方法]利用TAIL-PCR技术克隆百脉根IPT基因LjIPT3起始密码子的上游序列,利用生物信息学手段对其序列特征和潜在的调控元件进行分析,并构建启动子表达载体。[结果]利用TAIL-PCR技术成功克隆了LjIPT3基因5′端上游调控序列。将目的片段连接到pMD18-T载体上,获长度为1 910 bp序列,其3′端有部分序列与LjIPT3的5′端相同,证明克隆的片段为LjIPT3起始密码子ATG的上游区域。该序列含有1个TATA-box和3个CAAT-box,还包含光响应元件、MYB结合位点、不同的激素反应元件以及各种胁迫元件,说明该基因的表达可能受多种因素的调控。成功构建了驱动报告基因GUS的植物表达载体。[结论]该研究为研究植物细胞分裂素的合成代谢和植物生长发育的调控奠定了基础。     

水稻基因启动子Ospz1的克隆与表达特性研究

在水稻基因组芯片分析的基础上,克隆到一个在水稻中高水平表达基因OsSG15'末端启动子区域1.6-kb的DNA片断,即Ospz1启动子,构建了由Ospz1启动子引导的GUS重组基因,并经农杆菌介导将重组基因导入到水稻中.对转基因水稻植株中GUS活性的定性测定结果表明,Ospz1启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株叶片、芽和根中高效表达,而在其它器官中不表达或表达活性极弱,表现出组织特异性.Ospz1启动子可用于农作物生物技术的遗传改良.     

真核生物启动子TATA-box·GC-box和CAAT-box的分析

下载了已经通过试验证实的2 541条真核生物启动子序列,运用生物信息学方法分析了TATA-box、GC-box和CAAT-box的数量及其在启动子中的分布情况。结果表明,有23.85%真核生物启动子序列中至少有1个TATA-box,且TATA-box主要分布在转录起始位点前24~36 bp的区域内;有47.30%真核生物启动子序列中至少有1个GC-box,且GC-box在转录起始位点前23~128 bp的区域内分布比较集中;有42.35%真核生物启动子序列中至少有1个CAAT-box,且CAAT-box在转录起始位点前51~159 bp的区域内分布比较集中。这说明TATA-box在真核生物启动子中的位置比较固定,对基因转录的正确起始可能起着重要的作用;而GC-box和CAAT-box分布区域较广,数量也明显多于TATA-box。     

不同启动子调控下的t—PAcDNA乳腺定位表达

乳清酸蛋白 (WAP)和 β -酪蛋白 (β -Casein)是哺乳动物乳汁中的主要蛋白质 ,其基因 5′侧翼区常作为乳腺定位表达的调控序列。表达载体pSVL -WAP -tPA和pSVL - βb -tPA分别含 1.1kb的大鼠WAP启动子和 0 .6kb的牛β Casein启动子序列及t-PAcDNA。采用基因直接注射方法将 2种表达载体分别注入家兔乳腺中。溶圈试验结果显示 ,两种表达载体均能在兔乳腺细胞中得到表达 ,且以分娩后第 4天的乳汁中表达水平最高 ,分别为 45 0ng·mL-1和390ng·mL-1。为进一步研究t-PA基因乳腺定位表达调控和建立t-PA乳腺生物反应器奠定了基础。     

甘薯贮藏蛋白A基因5′端序列的克隆与分析

[目的]为开展Spo A基因表达调控规律的研究及利用SopA启动子片段构建甘薯高效表达载体提供理论依据。[方法]应用PCR技术从徐薯18中克隆出甘薯贮藏蛋白A基因5′端1条长度为348 bp的DNA片段,然后应用PLACE、PlantCARE在线启动子预测工具进行分析。[结果]Spo A启动子序列除含有TATA-box、CAAT-box等启动子的保守元件外,还有蔗糖诱导响应元件CMSRE1S、P8作用位点等重要的顺式作用元件,以及一些其他调控序列如MYB结合位点。从序列分析结果可以推测该基因的启动子具有蔗糖创伤诱导响应的功能。[结论]该研究分析和推测了Spo A启动子序列中的作用调控元件,为今后利用该启动子构建甘薯高效表达载体奠定了基础。