H5N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗H5N1禽流感病毒(AIV)的单克隆抗体(MAb),本研究以灭活的H5N1亚型A/Chickeen/Guangdong/S2261/2009(H5N1GD261)株免疫4周龄～6周龄BALB/c雌鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA及HI筛选获得了3株能稳定分泌抗HA的MAb杂交瘤细胞,分别命名为1A4、2F5和3D3.MAb亚类鉴定表明,2F5为IgM类,其它为IgG2a亚类,轻链均为k链.经血凝抑制检测,3株MAb均能与H5亚型的AIV结合,并具有较好的型广谱性.     

H3N2亚型犬流感病毒头部缺失血凝素蛋白的真核表达及抗原性研究

为获得一种针对不同亚型流感病毒的共同保护性抗原,本研究以H3N2亚型犬流感病毒(canine influenza virus, CIV)的主要抗原蛋白血凝素(HA)为靶标,以四甘氨酸接头肽替换HA头部结构域,将免疫反应定向至更保守的HA茎部区,同时在HA茎部添加T4折叠三聚体以保护蛋白天然构象,通过杆状病毒表达系统表达头部缺失HA蛋白,并验证其抗原性。结果表明,利用昆虫细胞表达的头部缺失,HA蛋白单一性较好,分子量为47 ku,与CIV全病毒血清抗体可发生特异性结合反应,且头部去除区HA蛋白血清抗体可抑制H1N1和H3N2亚型流感病毒感染所致的细胞病变效应,中和效价分别为1∶160和1∶320。研究结果为制备针对不同亚型流感病毒(如H1N1和H3N2)的广谱疫苗提供了可能。     

基于Spyligase技术的禽流感血凝素H5HA10多聚体抗原的高效制备

利用Spyligase技术在H5HA10序列的C端和N端分别加上SpyTag和KTag序列,并分别与His6-ArsC、His6-PAS200、His6-XTEN、His6-PEAT、SiTag3-SUMO、SiTag3-MBP、SiTag3-PAS200、SiTag3-XTEN和SiTag3-ArsC促溶标签相连,成功构建了含9种不同促溶性标签的H5HA10重组表达载体,同时构建了1种含有Cherry标签的Spyligase重组表达载体。将这10种重组载体分别转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达和SDS-PAGE分析,筛选出可以显著促进H5HA10重组蛋白表达的融合标签ArsC。通过优化诱导表达条件,在大量诱导表达、纯化后成功获得了高纯度的H5HA10和Spyligase重组蛋白,最终在PCT缓冲体系中, Spyligase促使H5HA10重组蛋白的蛋白聚合,形成了环化单体、三聚体、六聚体以及九聚体。     

血凝素的糖基化模式对G57基因型H9N2亚型禽流感病毒的稳定性和受体亲和性影响

G57基因型H9N2亚型禽流感病毒自2007年以来逐渐成为我国禽群中的优势基因型。序列分析显示，G57基因型病毒的血凝素主要存在5种糖基化模式。本研究利用反向遗传技术拯救了5株具有不同HA糖基化模式的病毒，分别命名为reHA7、reHA6、reHA5、reHA4、reHA3。稳定性试验结果显示，reHA6的热稳定性与酸稳定性最好，reHA7、reHA5次之，而reHA4、reHA3最弱。红细胞洗脱试验和红细胞凝集试验结果显示，reHA7的受体亲和性最强，reHA6、reHA5次之，而reHA4、reHA3最弱。固相结合试验结果显示，5株病毒均可与人型和禽型受体结合，并且reHA7与2种类型受体的亲和性最强，reHA6、reHA5次之，而reHA4、reHA3最弱。结果表明，血凝素糖基化模式影响H9N2亚型禽流感病毒的稳定性和受体亲和性，并以210位和305位糖基化位点的效应最为显著。本研究结果为深入理解H9N2亚型禽流感病毒的适应性进化提供了新的理论基础。     

血凝素糖基化模式对G57基因型H9N2亚型禽流感病毒抗原性的影响

G57基因型H9N2亚型流感病毒是当前威胁我国养禽业健康发展的重要病原。该病毒的免疫逃逸机制是值得探究的科学问题。本研究利用反向遗传技术拯救了5株具有不同血凝素(hemagglutinin, HA)糖基化模式的病毒。基于交叉血凝抑制结果绘制的抗原图谱显示，这5株病毒存在明显的抗原差异。这种差异与HA上的第21,210,289,304位糖基化位点直接相关，其对病毒抗原性的影响由大到小依次为304,210,289,21位糖基化位点。结果表明，HA糖链可能影响其周围的抗原表位的暴露程度，进而影响抗体与HA的结合，致使具有不同HA糖基化模式的病毒表现出抗原差异。因此，加强对流感病毒位点特异性糖基化的认识，从而更加准确地辨析HA糖基化与抗原距离的关系，对预测特定毒株的免疫逃逸能力以及疫苗的设计提供了依据。