表达H5亚型AIV HA和NA基因重组鸡痘病毒的构建及在高母源抗体商品鸡的免疫效力试验

母源抗体的干扰是重组鸡痘病毒(FPV)活载体基因工程疫苗至今未能得到推广应用的主要原因,本试验使用FPV新的复制非必需区构建的载体pP12-18构建在高母源抗体商品鸡具有较高免疫力的基因工程疫苗.将H5亚型禽流感病毒分离株的血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因定向插入鸡痘病毒转移载体pP12-18中,H5A和NA基因的启动子分别为PS和PE/L,获得用不同的启动子启动不同的外源基因且两基因盒方向为背向串联的重组转移载体p12LSH5HANA.将p12LSH5HANA转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中.p12LSH5HANA与wt-FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV-12LSH5HANA.通过在含X-Gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑,获得纯化的重组病毒.经传代证实该重组病毒具有良好的遗传稳定性.用105PFU的rFPV-12LSH5HANA免疫无特定病原体(SPF)鸡,能激发机体产生有效的血凝抑制(HI)抗体.初步的动物试验表明,该重组病毒能使经滴鼻点眼攻毒的SPF鸡抵抗H5亚型AIV的致死性攻击,保护率为100%.在高母源抗体的商品鸡上,rFPV-12LSH5HANA与原有载体构建的重组疫苗rF-PV-11SH5HANA的免疫效力有显著差异,保护率分别为81.4%和45.4%.结果表明,选择FPV合适的复制非必需区构建载体是提高重组FPV在高母源抗体商品鸡免疫效力的有效策略之一.     

抗禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体的病毒中和作用

通过血凝抑制(HI)和鸡胚中和试验(VN)证实，本实验室制备的抗禽流感H9M2单抗11A5和11B2株可特异性地抑制H9亚型禽流感病毒的血凝特性，而与禽流感H5和H7亚型以及其他具有血凝性感染禽类的病毒(如新城疫等)不反应。两株单抗腹水HI效价均达到15Log2。中和试验表明：上述两株单抗均可有效抑制H9N2病毒在SPF鸡胚中的增殖，使病毒失去血凝活性．测得11A5和11B2株腹水对H9N2禽流感病毒的半数保护量分别为10^-3.35和10^-4.58。该单抗的研制成功对于进一步建立快速鉴别诊断禽流感H9亚型病毒具有重要意义。     

禽流感病毒A/Chicken/Yangzhou/N/2005(H9N2)HA基因的克隆及序列分析

根据GenBank公开发表的H9N2型禽流感病毒血凝素(HA)基因序列设计1对引物,用RT-PCR方法成功扩增出H9N2型禽流感病毒分离株A/Chicken/Yangzhou/N/2005(H9N2)HA基因,凝胶电泳结果显示,扩增产物为1.7 kb的单一条带,与预期结果相符.将PCR扩增片段连接到pCR2.1-T载体上,重组质粒酶切鉴定正确.序列测定分析结果显示,所获序列与GenBank中收录的H9N2亚型分离株核苷酸同源性最高达99%,与原型毒株A/Furkey/Wisconsin/1/1966(H9N2)氨基酸同源性为89%.对HA裂解位点附近的氨基酸序列分析表明,此毒株为低致病力毒株.     

中国流行的2009甲型H1N1猪源流感病毒HA和NA基因的分子和遗传特征

目前流行的甲型H1N1流感病毒是一个复杂的基因重配病毒。对病毒的分子生物学研究,尤其是病毒囊膜蛋白血凝素（haemagglutini,HA）基因和神经氨酸酶（neuraminidase,NA）基因的研究,为控制和预防H1N1流感病毒具有重要的意义。本研究对中国流行的2009甲型H1N1猪源流感病毒的HA和NA基因与疫苗株A/California/07/2009（H1N1）,以及不同国家和地区的病毒株进行核苷酸和氨基酸序列分析。从NCBI的GenBank数据库下载所需要毒株的序列,采用Lasergene 6.0软件包中的EditSeq和MegAlign进行序列分析,进化树分析采用MEGA4.1软件。进化分析表明,中国流行的2009 H1N1流感病毒与疫苗株的核苷酸同源率分别在98.8%~99.7%和98.6%~99.6%之间;裂解位点处为I/VPSIQSR↓G,不具备高致病性流感病毒的特征;有1株NA抗性病毒。尽管与疫苗株相比,中国流行株2009甲型H1N1猪源流感病毒的HA和NA基因有部分突变,但这些突变并不是重要的。本研究首次详细分析了中国流行的2009甲型H1N1猪源流感病毒株与疫苗株的HA和NA基因的分子特征,对实时监测流感病毒HA和NA基因的变化具有重要意义。     

新城疫病毒HN蛋白抗原表位分析及结构域基因原核表达

以本实验室构建的含新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶基因重组质粒为模板，设计引物通过PCR和重叠-延伸PCR扩增，获得HNa、HNb和HNa-L-b三种抗原结构域基因片段，BamHⅠ／HindⅢ双酶切定向克隆到原核表达载体pET32c，获得重组质粒分别命名为pET32c—HNa、pET32c-HNb和pET32c．HNa—L—b。重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21，筛选出阳性克隆，诱导表达并取产物进行分析。结果表明，HNa、HNb、HNa-L-b结构域基因片段均获得了融合表达。Western-blotting分析证实表达产物HNa和HNb与NDV阳性血清具有免疫反应性。本试验结果为进一步研究HN蛋白抗原结构域的免疫原性以及HN蛋白与F蛋白在细胞融合中的相互作用奠定了基础。     

反向遗传操作在新城疫病毒中的应用

新城疫（Newcastle disease。ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起多种禽类发生高度死亡的一种急性传染病。NDV属于副粘病毒科禽腮腺炎病毒属,是负链RNA,全长为15186bp或15 192bp。     

2013年云南省禽流感病毒H9N2亚型监测及其血凝素基因序列分析

为了解H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的变异情况,本研究对2013年云南省16个地区的3 622份家禽临床样品进行AIV的鸡胚分离和RT-PCR检测,其中分离鉴定到97份H9N2亚型AIV分离株,并选取21个分离株进行HA基因测序及系统进化分析,结果表明:21份H9N2亚型AIV分离株的HA基因核苷酸序列同源性为86.0%~99.4%,均属于欧亚分支的类A/Chicken/Bei Jing/1/1994亚分支,而且又进一步划分为Ⅲ-1、Ⅲ-2两个小分支。其中Ⅲ-2分支为云南地区新出现的进化分支。氨基酸比对分析显示,测序的21个HA基因编码蛋白的裂解位点基序均具有低致病性病毒分子特征;与现用疫苗株相比,HA推导氨基酸序列中存在多个氨基酸位点差异;其中,Ⅲ-1与Ⅲ-2分支的AIV的HA氨基酸序列多个位点存在各自特有的点突变(氨基酸替换),这种变异具有一定的进化(亚)分支特异性。此外,HA基因多个受体结合位点氨基酸存在变异,其中234位氨基酸全部变为L,呈现了人流感受体结合特性;部分糖基化位点、抗原表位关键性氨基酸也存在变异。     

鸭源流感病毒分离株表面蛋白基因的克隆及序列分析

从湖南分离得到一株H5N1亚型禽流感病毒(AIV),首先设计合成两对HA和NA基因特异性引物,采用两步法RT-PCR,对鸭流感病毒株 A/Duck/HunanWugang/2/2004(H5N1)(简称DK/HNWG/2/04)的表面蛋白基因进行序列测定,并与国内外已经发表的H5N1亚型毒株表面蛋白基因进行序列分析和比较.结果表明,HA和NA基因全长分别约为1.7 kb和1.4 kb,分离株与14个参考毒株HA基因的同源性为95.9%～98.0%,NA基因的同源性为87.0%～98.4%.根据HA基因核苷酸序列推导HA裂解位点氨基酸,发现分离株的裂解位点包含多个碱性氨基酸,符合高致病性禽流感的特征.     

流感病毒血凝素在宿主特异性转变中的分子基础

流感病毒宿主感染谱很广,除野生鸟类外,还广泛存在于家禽、家畜、野生哺乳动物甚至海生哺乳动物和人类[1]。种系发生研究表明,感染其他物种的所有A型流感病毒都来源于野生鸟类,野生鸟类是迄今发现所有16个HA亚型和9个NA亚型流感病毒的天然宿主[2-3]在一定条件下,流感病毒可在不同物种之间发生直接或间接的相互传播。历史上流感病毒跨越种间屏障的现象屡见不鲜。例如,禽流感病毒长期以来仅在禽间存在与流行,但1918年H1N1亚型病毒导致了“西班牙人流感”;1957年,H2N2亚型病毒酿成“亚洲人流感”;1968年,H3N2亚型病毒导致“香港流感”的蔓延;1977年,H1N1亚型病毒再次导致了“俄罗斯流感”;1997年,香港发生了H5N1亚型禽流感病毒感染并致死人的事件[4];2003年底至2008年4月30日,H5N1亚型禽流感病毒再次于东南亚等国家肆虐,引发382人感染,其中241人死亡的事件。由此,流感病毒跨越种间屏障的现象引起了全球的关注。很多学者对流感病毒跨种间屏障机制的研究给予了高度重视并取得了诸多的研究进展。不同病毒的感染机制表明,当病毒在一个物种群体中经过多次感染,就会受到1次与宿主特性相关的自然选择过程...     

猪流感病毒HA基因的原核表达及其ELISA检测方法的建立

根据H1N1亚型猪流感病毒血凝素基因序列设计并合成特异性引物,从本室保存的H1N1亚型猪流感病毒中扩增信号肽和跨膜区缺失的血凝素基因,并将其克隆到原核表达载体pET-28a中,在大肠埃希菌中诱导表达.对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blot的结果表明,HA基因在大肠埃希菌中获得表达,产物具有免疫学活性,表达蛋白分子质量约为55 ku.表达产物经过纯化作为包被抗原建立了检测H1亚型猪流感抗体的间接ELISA方法.该方法具有较高的特异性和敏感性,重复性良好.应用该方法对2006年2 584份临床猪血清进行检测,结果显示多个地区检测猪流感抗体出现阳性,平均为20.5%.在6月、7月和12月分别出现抗体水平高峰,分别高达25.4%、25.0%和35.5%.