利用地下采矿水养殖棘腹蛙研究初报

于2008年3月～2009年7月对在采矿水养殖条件下刚完成变态发育到性成熟期间的棘腹蛙的生长情况进行了较详细的观察和记录.研究结果表明:经过16个月的精心养殖,棘腹蛙非冬眠组的体重、体长均大于冬眠组,并早于冬眠组达到性成熟;棘腹蛙由幼蛙发育到性成熟的体重增长经历了"慢-快-慢-快-慢"5个阶段,体长增长则经历了"慢-快-慢"3个阶段;平均相对吃食率为5.85%.     

洋县饰纹姬蛙种群分布与密度研究

2015年1月至2016年12月,采用野外样线样方调查和调查因子整理统计分析的综合方法,对饰纹姬蛙种群分布区域和密度进行研究。结果表明,饰纹姬蛙一般10月陆续进入冬眠期,次年惊蛰过后相继苏醒,4月以后逐渐抱对产卵。稻田分布密度较大,低海拔种群密度高于高海拔,分布海拔区间在500~1 650 m之间。食物有蚂蚁、白蚁和小型昆虫。平均产卵量为225粒;孵化期7 d;蝌蚪期70 d;2年长成成体。稻田是蛙类的最佳栖息地,保护好稻田是有效保护饰纹姬蛙的关键措施。     

蛙类歪头、破头与白眼综合征病原分析

为探明湖北、福建等主养区一系列蛙疾病的发病原因,从具有典型歪头、破头与白眼等症状的蛙脑部和内脏器官分离到40株优势菌。经16S rRNA 基因序列比对,发现40株优势菌均与米尔伊丽莎白菌(Elizabethkingia miricola)同源。经生理生化鉴定、系统发育分析发现,这40株优势菌存在遗传差异,宿主和区域是影响亲缘关系的重要因素,并判定菌株典型株QW08为米尔伊丽莎白菌。回归感染实验证实QW08为蛙类歪头、破头与白眼病的病原菌。组织病理学观察显示,米尔伊丽莎白菌感染黑斑蛙可引起其全身多脏器与组织损伤,脑、肠道、肝、脾与肾等组织器官损伤极其严重,主要病理变化表现为变性、坏死和炎症反应,致多组织器官功能障碍而引起感染蛙死亡。药敏特性分析显示,分离株QW08仅对氟苯尼考高度敏感,对其余19种抗生素表现出不同程度的耐药。研究结果为蛙类该病防控提供了理论依据。     

铜仁市小面积稻田养殖黑斑蛙生态种养技术

通过开展小面积稻田养殖黑斑蛙试验研究，实现每亩产黑斑蛙986.16千克、水稻454.13千克，纯收益12510.98元/亩，且有效降低了化肥、农药使用量，增强了农民种植水稻的积极性，取得了水稻、水产“双水双绿、稻蛙双丰”,经济效益、社会效益、生态效益相互促进、同步提升的良好效果。     

棘胸蛙出血性败血症的病原菌分离鉴定与病理学研究

自患出血性败血症的棘胸蛙肝脏与腹水中分离出1株革兰氏阴性短杆菌，回归感染证实为此次导致棘胸蛙发病的病原菌，该菌对棘胸蛙的半数致死剂量为1.59×10⁶ cfu/g。表型特征鉴定、16S rDNA与gyrB基因测序显示，该分离菌株为嗜水气单胞菌。该菌株对恩诺沙星、四环素、氟苯尼考等药物敏感，对头孢氨苄、青霉素及磺胺异噁唑等药物耐药。组织病理学观察显示，病蛙脾肿大，白髓坏死、面积显著缩小，红髓纤维架构断裂，脾索消失，大量红细胞瘀滞；心外膜极度肿胀，心包内有大量炎性渗出物；肾小管透明变性，肾间质结缔组织松散；肝细胞肿胀，局灶性坏死；脑组织内神经细胞变性坏死。电镜下可见脾内细胞坏死、纤维断裂，巨噬细胞内吞噬有侵染的菌体，网状细胞逐渐转变为黑色素巨噬细胞。试验结果可为川渝地区棘胸蛙的健康养殖与疾病防治提供科学依据。     

不同稻田种养模式对水稻生长、二化螟及杂草的影响

为探究不同稻田种养模式对水稻生长特性、二化螟及杂草防控效果的影响，设置稻田养牛蛙（DNW）、稻田养黑斑蛙（DW）、稻田养鱼（DY）和水稻单作（CK）4个处理，调查各处理水稻叶面积指数、干物质积累量、水稻产量及产量构成、二化螟虫口密度和杂草密度。结果表明，在齐穗期，DW处理的叶面积指数较CK显著增加15.23%；在水稻生长期DW处理对二化螟的防治效果为49.60%，杂草密度防治效果为73.78%，杂草干物质防治效果为76.44%,DW处理的杂草干物质量较CK显著下降。DW、DNW处理成熟期的穗干物质量较CK分别高3.21%和12.10%，但差异不显著。DW处理的有效穗数、穗粒数较CK显著增加19.45%和18.50%。水稻实际产量各处理间差异不显著，DW与CK一致，DNW比CK增产9.89%，稻蛙共作具有较好的稳产效果。综上所述，“稻-黑斑蛙”共生能提高水稻光合作用，减少二化螟危害和稻田杂草发生，达到稳定水稻产量、减少农药使用的目的。     

黑斑侧褶蛙脑微血管内皮细胞的原代培养及鉴定

为了建立蛙脑微血管内皮细胞原代培养方法，实验以黑斑侧褶蛙脑组织为实验材料，在无菌条件下分离出大脑灰质，利用0.1%Ⅱ型胶原酶和胶原酶-分散酶进行消化，经过Percoll密度梯度离心后，将获取的脑微血管段接种于鼠尾胶包被的培养瓶中，于28°C、5%CO₂条件下原代培养蛙脑微血管内皮细胞，并通过细胞形态学观察和Ⅷ因子相关抗原免疫荧光对细胞进行鉴定，最后用四唑蓝比色法(MTT)测定细胞的生长状态。结果显示，微血管段在体外培养1 d后开始贴壁生长，并逐渐扩大成团簇状，培养至7 d时，细胞呈“铺石路样”镶嵌式排列，表现为区域性单层生长；Ⅷ因子免疫荧光检测发现胞质呈红色，表达为阳性，阳性细胞率达97%以上；MTT实验显示，细胞在第3～5天时生长速率最快。本研究首次建立了蛙脑微血管内皮细胞的原代培养与鉴定方法，为体外研究蛙类神经性疾病的发病机理奠定基础，也为相关药物的研发和筛选提供了细胞模型。     

一株湖北源大口黑鲈蛙病毒的分离鉴定

采用电子显微镜观察和细胞培养等技术, 从湖北黄陂某养殖场患病大口黑鲈(Micropterus salmoides)体内发现并分离到一株蛙病毒。患病大口黑鲈的临床症状主要表现为体表出血、溃疡, 肝脏发白。将病鱼内脏组织匀浆超微滤液接种鳜脑细胞系(mandarin fish brain, MFB)细胞能产生典型细胞病变效应(cytopathic effect, CPE), 病毒滴度达到 10^8.36±0.15 TCID₅₀/mL。细胞培养病毒的超薄切片电镜观察结果显示, 细胞质中存在大量直径约为 150 nm 左右的正六边形病毒粒子, 呈晶格排列。细胞培养病毒的人工感染大口黑鲈试验结果显示, 7 d 内试验鱼死亡率高达 100%, 其临床症状与自然发病鱼相似。采用大口黑鲈病毒(largemouth bass virus, LMBV)的特异性 PCR 检测方法对患病鲈组织样品和细胞培养病毒样品进行检测, 均能扩增出 241 bp 的单一目的条带。进一步根据 GenBank 中 LMBV 主衣壳蛋白(major capsid protein, MCP)基因序列设计特异性引物, 均能从上述样品中扩增出 1392 bp 的 MCP 基因开放阅读框(open reading frame, ORF)全长。将 MCP 氨基酸全序列进行比对, 结果显示其与 Santee-Cooper 蛙病毒、孔雀鱼病毒 6 型及大口黑鲈溃疡综合征病毒的 MCP 氨基酸序列同源性高达 100%。系统进化结果显示, 与感染鱼类的虹彩病毒科蛙病毒属病毒, 如鳜鱼蛙病毒、Santee-Cooper 蛙病毒、孔雀鱼病毒 6 型和大口黑鲈溃疡综合征病毒等聚成一支。这些结果证明, 该分离株为虹彩病毒科蛙病毒属的成员, 暂命名为大口黑鲈蛙病毒(largemouth bass ranavirus, LMBRaV)湖北株 LMBRaV-HB001。病毒敏感细胞系筛选试验结果表明, 病毒 LMBRaV-HB001 感染鲤上皮瘤细胞(epithelioma papulosum cyprinid, EPC)、草鱼性腺细胞(grass carp ovary, GCO)、大鲵肌肉细胞(giant salamander muscle, GSM)和鲫脑组织细胞(gibel carp brain, GiCB)均能产生典型 CPE, 病毒滴度可达 10^8.0 TCID₅₀/mL 以上。本研究首次在湖北省养殖大口黑鲈体内分离与鉴定了 LMBRaV 病毒, 建立了病毒的细胞培养方法, 为进一步研究该病毒的传播、诊断和防控技术提供了重要参考。     

泽陆蛙变态前后身体和器官大小及PHA-P反应的变化

为探究蝌蚪变态前后形态表型、内脏器官大小和免疫功能与特定生活史阶段的关系，测定了泽陆蛙（Fejervarya multistriata）从37期蝌蚪发育至46期幼蛙，多个关键生活史阶段身体大小、内脏器官系数及对植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA-P）的反应的变化。结果显示：（1）泽陆蛙的体重、体宽、尾长和体全长都从37期至40～41期升高，之后下降，至46期降至最低值（P < 0.05）；体长42～43期最高，显著高于37期和46期（P < 0.05）。（2）肝、脂肪体和肾湿重系数都在44～45期最高，38～39期最低（P < 0.05），而鳃或肺湿重系数37期显著高于其他发育阶段（P < 0.05），消化道长度系数37期、38～39期和40～41期都显著高于42～43期、44～45期和46期（P < 0.05），心和脾湿重系数均不随发育阶段而变化（P > 0.05）。（3）对PHA-P的反应的最大反应值37期蝌蚪出现于注射后2 h，38～39和42～43期见于3 h，其他发育阶段见于4 h，42～43期蝌蚪显著高于38～39期蝌蚪和46期幼蛙（P < 0.05）。从水生到陆生，泽陆蛙的形态表型变化先于内脏器官大小，以被延迟和下降的免疫功能为代价，影响其成功登陆。     

不同海拔对稻蛙共作水稻生长性状 及光合作用的影响

为了探讨稻田引入黑斑蛙后，分析不同海拔高度下稻蛙共作对水稻生长性状及光合作用的影响，分别于水稻 的返青期、分蘖期，抽穗期，成熟期测定水稻的株高、分蘖数、叶绿素含量和净光合速率的变化情况。结果表明，不同海 拔高度的不同密度处理组株高均显著高于水稻单作，其中，抽穗期，白元村的水稻株高、分蘖数、叶绿素相对含量以及 净光合作用速率均明显高于坪峨村和七百渡村。综上所述，在本试验的条件下，稻蛙共作技术是增产增效的生态种养 模式，在研究的三个海拔高度重，海拔高度为600m 左右比较适宜，本试验的相关结果为稻蛙（黑斑蛙）生态种养模式的 推广应用提供科学的实践指导。