猪弓形虫实时荧光PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、敏感、特异的猪弓形虫检测方法,根据弓形虫保守基因序列,设计一套特异性引物和FAM荧光素标记的MGB探针;通过对PCR反应体系和反应条件进行优化筛选,建立了猪弓形虫实时荧光定量PCR检测方法,并对此PCR检测方法进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法对60份疑似弓形虫感染的临床样品进行了检测。结果显示:建立的猪弓形虫实时荧光定量PCR检测方法在101～107拷贝/μL模板范围内有很好的线性关系;对弓形虫重组阳性质粒出现阳性扩增信号,但对阴性对照的水和其他7种病原对照未扩增出特异性曲线;最低检测模板浓度为10拷贝/μL;自60份疑似猪弓形虫感染样品中检出32份阳性,并且和克隆测序结果一致。结果表明,本研究建立的猪弓形虫实时荧光定量PCR检测方法可用于猪弓形虫的快速检测,从而为猪弓形虫病的诊断提供了特异、敏感、高通量的方法。     

羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

山羊痘和绵羊痘是由羊痘病毒引起的一种急性、热性、接触性传染病。为了更快、更准确的诊断该病,本研究根据Gen Bank已经发表的GTPV和SPPV参考毒株(登录号分别为AY077836和AY077832)A29L基因序列,设计合成了1对特异性引物和2条Taq Man探针,同时制备重组质粒标准品。经过反应条件的优化,建立了羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法,对所建立的实时荧光定量PCR方法反应体系的特异性、灵敏性和重复性进行了评价,并用此方法对19份临床样品进行了检测。结果显示:该诊断方法与4种非羊痘病毒不发生交叉反应,并且山羊痘病毒和绵羊痘病毒之间也不发生交叉反应。该方法的重复性试验变异系数均低于2%,并且双重实时荧光定量PCR最低浓度检测限分别为470和440 fg。对标准阳性模板进行定量检测,生成的标准曲线相关系数分别为0.995和0.997。在检测的临床样品中,GTPV和SPPV阳性分别有14和4份,混合感染有1份。结果表明所建立的方法具有良好的特异性,灵敏性、稳定性,可以对GTPV和SPPV进行准确的定量检测。     

口蹄疫病毒通用型和A型二重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速、敏感、特异的口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)分型鉴别诊断实时荧光RT-PCR(Fluorescence quantitative,FQ-PCR)检测方法,根据O、A、AsiaⅠ三种血清型FMDV保守基因序列,设计能够检测到FMDV的特异性通用检测引物和A型检测引物,以及不同荧光素标记的MGB探针。通过对PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立了FMDV通用型和A型二重实时荧光RT-PCR检测方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法,对123份疑似FMDV感染的临床样品进行了检测。结果显示,建立的FMDV通用型、A型二重实时荧光RT-PCR检测方法在10~1～10~7拷贝/μL模板范围内有很好的线性关系;对pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A重组质粒出现阳性扩增信号,但对正常细胞培养物对照和其他7种病原对照未扩增出特异性曲线;自123份疑似FMDV感染样品中,检出10份FMDV-T阳性,6份FMDV-T/FMDV-A双阳性并且与基因测序结果一致。结果表明,本研究建立的FMDV通用型、A型二重实时荧光RT-PCR检测方法重复性好、敏感性高、特异性强,最低检测模板浓度为10拷贝/μL,可用于FMDV的快速分型检测,为FMDV的早期检测及临床诊断提供了新方法。     

我国首例小反刍兽疫诊断报告

2007年7月我国西藏发生不明山羊疫情,国家外来动物病诊断中心对当地动物疫病控制中心送检的14只病死山羊病料和一批血清样品分别进行病原学和血清学检测。利用较敏感的小反刍兽疫病毒(PPRV)特异性荧光定量RT-PCR方法,在11只病羊组织中检测到小反刍兽疫病毒核酸。利用次敏感的PPRV普通RT-PCR方法,从8只病羊组织中检测到PPRV核酸。针对1号样本病原核酸N基因和F基因片段进行遗传发生分析,该病原属于4系。利用竞争ELISA试剂盒对送检的13份血清样本进行抗体检测,结果全部阳性。将1号组织样本接种Vero细胞分离病毒,透射电镜观察下,发现了500纳米左右的病毒粒子。对分离毒株进行PCR检测同样证实其为PPRV。     

氮素水平对转C4光合基因水稻花期剑叶PSⅡ荧光特性的影响

为探讨转C4光合基因水稻在生育后期剑叶PSⅡ对氮素水平的响应特性,采用转pepc(PC)、ppdk(PK)、pepc + ppdk(CK)和未转基因的Kitaake (WT)为试验材料,测定了不同氮素条件下(0.7 mmol/L(1/4N)、3 mmol/L (1N)、6mmol/L(2N))不同品种剑叶SPAD值和形态学指标的变化,并运用叶绿素荧光动力学技术测定了各个品种叶绿素荧光动力学曲线和荧光参数的变化.结果表明,1/4N处理能增加各品种的根长,减小剑叶面积、株高以及叶片叶绿素含量,2N能使剑叶面积和叶绿素含量增加,转C4光合基因品种叶绿素含量在1/4N氮条件下具有显著优势,PC在1/4N条件下具有最长根长和最大剑叶面积,具有显著的形态学优势.1/4N处理使所有品种的荧光曲线出现了K相(300μs处)的增加,转C4基因水稻材料K相的峰值都比原种低,PC的峰值最低.叶绿素荧光曲线分析表明,低氮破坏了剑叶PSⅡ的构造,造成所有品种PSⅡ的OEC失活,从而出现300 μs处K相的增加,低氮还造成所有品种失活反应中心增加,电子传递活性减弱,热耗散增加,进而造成PSⅡ最大光化学活性的减小.而PC在低氮当中PSⅡ的所有指标都显著高于其他品种,具有相对稳定的PSⅡ结构,具有耐低氮的优势.高氮对各品种PSⅡ光化学活性的影响不大.     

实时定量PCR检测技术研究进展

传统定量PCR检测方法如内参照法和竞争PCR法,因为在达到平台期后才能对其进行检测,由于PCR扩增已经过了对数期,其检测重复性相对较差.而实时荧光定量PCR技术可直接监测PCR过程中荧光信号的变化,以获得目的区段扩增产物定量的结果,直接可以进行定性分析和定量分析,操作简便无污染.本文通过对实时荧光定量PCR检测技术的原理、分类、方法和应用4个方面阐述实时定量PCR检测技术研究进展.     

黑杨三倍体与二倍体叶片中miRNA表达差异研究

本文以改进CTAB法提取的总RNA为模板,通过设计茎环反转录引物,利用定量RT-PCR技术从黑杨幼嫩叶片、成熟叶片中均检测到miRNA。结果表明,miR159、miR167、miR171、miR319在三倍体幼叶中表达量均高于二倍体,miR164在三倍体成熟叶片中的表达量高于二倍体表达量。除miR319外,其余miRNA与其相应的靶基因在二倍体和三倍体黑杨不同阶段叶片中表达的消长关系都较为典型。暗示这些miRNA 靶基因可能与黑杨三倍体的速生性状形成相关。     

珍珠豆型花生品种白沙1016核型分析

珍珠豆型花生白沙1016是重要的花生种质资源.利用高度保守的重复序列5S和45SrDNA作探针对白沙1016根尖细胞中期染色体进行荧光原位杂交(FISH)分析,发现两探针在白沙1016的12条染色体上能产生杂交信号,其中1对染色体长臂与短臂、2对染色体短臂、3对染色体长臂具有杂交信号.综合DAPI+染色带纹和染色体长度、臂比、面积等特征,可以将白沙1016大部分染色体区分开,为白沙1016的育种利用提供了染色体遗传分析基础.     

不同O/L值花生品种油酸脱氢酶基因的时空表达特征

本研究以不同油酸/亚油酸比值（O/L比）花生品种为材料,利用实时荧光定量PCR技术,对四个不同O/L花生品种不同组织中油酸脱氢酶基因（FAD2）的表达进行相对定量分析。结果表明：FAD2基因在不同O/L基因型中组成型表达,其在根、茎、叶中表达量低,在花中表达量最高,显著高于荚果等其它组织中的表达量,且品种间差异达显著水平;花U606和花U12在花、幼荚、成熟荚果中的表达量呈依次下降趋势;花育17和狮油红4号在花、幼荚、成熟荚果中的表达量则呈现高-低-次高的表达趋势,差异达显著水平。       

青藏高原几种高山植物的光合生理特性

以14种高寒草甸植物为材料,研究分析植物叶片的光合色素含量和叶绿素荧光参数,以探究高寒草甸植物适应青藏高原极端环境的光合生理机制。结果表明,黄花鸢尾(Iris pseudoacorus)、美丽风毛菊(Saussurea pulchra)、鹅绒委陵菜(Potentilla anserina)和天蓝苜蓿(Medicago lupulina)叶片的单位面积叶绿素含量分别比黄帚橐吾(Ligularia virgaurea)高284.83%、200.56%、171.35%和148.31%,叶片PSⅡ有效光化学量子产量分别高79.99%、73.94%、68.37%和63.90%,叶片PSⅡ实际光化学效率也具有相同的变化趋势;而黄花鸢尾、美丽风毛菊、兰石草(Lancea tibetica)和麻花艽(Gentiana straminea)叶片的单位叶面积类胡萝卜素含量分别比天蓝苜蓿高393.93%、348.48%、260.61%和233.33%,其叶片的非光化学猝灭也显著高于天蓝苜蓿;黄帚橐吾、珠芽蓼（Polygonum viviparnm）和柔软紫苑(Aster flaccidus)叶片的叶绿素a/b值高于2.91,能适应较强光照,而天蓝苜蓿叶片的叶绿素a/b值小于2.5,常生长于植被下层,说明植物能够通过调整光合色素含量和构成而合理有效地利用光能以适应特殊的环境条件。