轮状病毒NSP1和NSP3蛋白真核表达载体构建、表达及其调控Ⅰ型干扰素信号通路的功能

[目的]旨在构建轮状病毒(Rotavirus,RV)非结构蛋白1(NSP1)和3(NSP3)真核表达载体,并在人胚肾上皮HEK239T细胞中表达,随后研究轮状病毒NSP1和NSP3在体外初步影响IFN-β/ISRE报告基因活性.[方法]首先合成猿轮状病毒SA11株NSP1、NSP3编码基因连接到克隆载体pUCm-T上,...     

猪生殖细胞特异性基因Sohlh1及启动子的研究

【目的】探究猪生殖细胞特异性基因Sohlh1在幼年和成年各组织中的表达情况,分子遗传进化特点,及其启动子的核心区域和特异性调控区间。【方法】通过RT-PCR验证猪不同时期不同组织Sohlh1基因的表达情况,通过生物软件分析其分子遗传进化特点,构建启动子验证载体,通过双荧光素酶分析基因启动子的核心区域和特异性调控区间。【结果】Sohlh1基因在仔猪与成年猪睾丸和仔猪卵巢中都有表达,在成年猪卵巢不表达;通过多个物种进化分析,Sohlh1基因随着脊椎动物从低等到高等的演变也在进化;通过双荧光素酶分析构建的启动子验证载体,猪Sohlh1基因的启动子的核心区域在78 bp附近,特异性调控区间在771~2 981 bp之间。【结论】基于Sohlh1基因的进化分析,作为试验动物模型,猪可能更优于啮齿类动物,其组织特异性表达可能主要通过其启动子特异性调控区间调控。     

猪miR-369靶基因肿瘤坏死抑制因子-α(TNF-α)的鉴定

microRNAs(miRNAs)是一类长约22nt的非编码小RNA分子,作为关键的转录后调控因子调控真核生物的基因表达,广泛参与细胞的生长发育、分化和凋亡等生物学过程。本研究通过生物信息学预测发现,猪(Susscrofa)肿瘤坏死抑制因子-α(TNF-α)的3’非编码区具有2个潜在的miR-369的靶位点。并进一步通过双荧光素酶报告系统分析,将猪TNF-α3’非编码区构建到双荧光素酶载体中,转染至猪髋动脉内皮细胞系,荧光素酶活性测定显示,miR-369过表达组的荧光比值显著低于对照组(P<0.05),而miR-369抑制组相比对照组没有显著差异(P=0.752)。研究结果提示,猪miR-369能靶向调控TNF-α的表达,对深入研究脂肪沉积性状重要候选基因TNF-α的转录后调控机制具有重要价值。     

团头鲂白细胞介素6基因启动子报告载体的构建及活性分析

为了解鱼类白细胞介素6(IL-6)基因的转录调控原理及其免疫作用机制,构建5个团头鲂il-6基因启动子的荧光素酶报告质粒(PGL3-IL-6P),以PGL3-basic质粒作为阴性对照,将它们分别与内参质粒pRL-TK共转染进鲤EPC细胞,并用100ng/mL的LPS诱导转染过重组载体的细胞,24h后检测荧光素酶的活性。结果显示:与阴性对照组相比,质粒转染组PGL3-IL-6P-0、PGL3-IL-6P-1、PGL3-IL-6P-2、PGL3-IL-6P-3与PGL3-IL-6P-4的荧光素酶活性均明显升高,其中PGL3-IL-6P-4组的荧光素酶活性最高,表明该启动子缺失体(-379至+34)包含il-6的核心启动子。用LPS刺激转染过重组载体的细胞后发现,与未经LPS刺激的对照组相比,仅PGL3-IL-6P-4组的活性明显增强,而其余缺失体的活性则没有显著变化,这进一步表明PGL3-IL-6P-4缺失体包含核心启动子区,并推测该核心启动子区域存在的潜在转录因子NF-κB与C/EBPβ等可能是响应LPS刺激的重要作用元件。     

五种鳗鲡的含肉率及肌肉营养成分分析

为了阐明鱼类TANK结合激酶1 (TBK1)在免疫应答密切相关的NF-κB、I型IFN及MAPK信号通路中的调控作用,本实验通过cDNA末端快速扩增技术 (SMART RACE)从日本鳗鲡中克隆了TBK1基因cDNA全长序列,命名为AjTBK1,利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测了在体和离体状态下不同病原体相关分子模式 (PAMPs)及嗜水气单胞菌对日本鳗鲡AjTBK1基因表达水平变化的影响,通过构建绿色荧光蛋白pEGFP-TBK1和pCMV-TBK1真核表达质粒对AjTBK1亚细胞定位以及AjTBK1过表达对NF-κB、AP-1、IFN-β启动子荧光素酶活性的激活作用进行研究。蛋白质序列分析显示,日本鳗鲡AjTBK1编码731个氨基酸,其三维丝带空间结构与人类 TBK1相似,具有保守的激酶结构域 (KD)、泛素样结构域 (ULD)、二聚化支架结构域 (SDD)以及C端结构域 (CTD),在系统发育树中与其他鱼类TBK1家族聚为一支。qRT-PCR检测发现AjTBK1在多种组织中广泛表达,且在肝脏和肠中高表达。经LPS、poly I:C、嗜水气单胞菌免疫注射后,AjTBK1基因表达水平在日本鳗鲡肝脏中显著提高,而肾脏中的表达量则在LPS和poly I:C刺激后显著降低。离体实验中,经LPS、poly I:C、PGN以及不同浓度嗜水气单胞菌刺激后的日本鳗鲡肝脏细胞AjTBK1基因表达水平均有显著升高。亚细胞定位结果显示,天然状态下的AjTBK1在HEK293细胞质中分布,经LPS和poly I:C刺激后呈聚集点状分布。此外,双荧光素酶活性检测发现过表达的AjTBK1可显著增强NF-κB、AP-1和IFN-β启动子荧光素酶活性。以上研究表明,AjTBK1可以通过激活NF-κB、AP-1和I型IFN信号通路,在机体抗细菌和抗病毒先天免疫应答中发挥重要的调控作用。

     

鱼类低氧胁迫及营养调控和应对研究进展

为了探究miR-17a-5p在鲢低氧胁迫下的功能,在前期鲢small RNA测序的基础上对鲢miR-17a-5p进行靶基因预测及功能富集分析,通过双荧光素酶活性验证其与HIF-1α的靶向关系,并检测低氧胁迫下miR-17a-5p和其靶基因在鲢肝脏、脑、心脏和鳃四个组织中的动态表达特征。结果显示,鲢miR-17a-5p在不同物种间高度保守,预测出381个miR-17a-5p的潜在靶基因显著富集在硫代谢、mTOR信号通路以及萜类骨架的生物合成3个KEGG信号通路上。miR-17a-5p可与HIF-1α mRNA的3′UTR结合,并降低HIF-1α mRNA水平,低氧胁迫下miR-17a-5p的表达呈下降趋势,而HIF-1α表达则呈上升趋势;3个显著富集KEGG通路中的11个miR-17a-5p潜在靶基因在低氧胁迫过程中的不同组织中的表达,尤其是肝脏中的表达,除SGK1外,均呈显著上升趋势。研究表明,低氧胁迫下鲢各组织中miR-17a-5p的表达下调减弱了其对靶基因的抑制作用,进而导致HIF-1α、ddit4和Lrp5等响应低氧胁迫的基因表达上调。本研究为低氧胁迫下鲢miRNA的表达与调控机制提供新见解,也为培育耐低氧的鲢新品系(种)提供了参考。     

基于荧光素酶活体成像筛选转基因玉米植株的条件优化

通过比较活体成像系统中不同玉米芽长、曝光时间及合并像素值的荧光素酶信号强弱,优化利用活体成像系统筛选转荧光素酶玉米植株的条件。结果表明,在玉米芽长3～8 cm、喷施底物反应2 min后曝光时间5 min、像素合并值binning 8×8的条件下,能够较好地检测到植株荧光素酶信号;进一步对获得的转基因玉米植株进行活体检测,确定了信噪比值大于2.0的植株为强表达阳性植株。研究结果可为转基因植株的后代筛选提供新方法,可以淘汰大量非转基因和表达较弱的植株或株系,有效提高筛选效率。     

gfp/luxAB双标记载体在抗线虫菌株BC200O中的转化及表达检测

以抗线虫(Alcaligenes faecalis)生防菌BC2000为出发菌株，用带有gfp/1uxAB双标记基因的pUTmini-Tn5转座载体，通过电转化法将gfp和1uxAB基因整合到BC2000染色体上。转化子的最终筛选依赖于立体荧光显微镜对菌落的荧光检测，对筛选平板上的菌落进行荧光检测后获得发强烈绿色荧光的标记菌，并命名为BC2001。PCR结果表明，从BC2001的基因组DNA中扩增出约700bp的gfp基因片段。另外标记菌在共聚焦显微镜中观察发现，菌体形态与出发菌YKT相同，均为椭球形或短杆状；标记菌在LB培养过程中荧光素酶活性监测发现，在标记菌的对数生长期，荧光素酶活性快速增加，到了稳定期，由于细胞代谢活性下降导致荧光素酶活性降低，而对照的出发菌株整个生长过程均检测不到荧光素酶活性。这些结果表明，由启动子psbA控制的譬gfp和1uxAB融合基因成功地转化BC2000并在标记菌BC2001中得到高效表达。     

LDLR激动剂模型的建立及上调LDLR功能的黑茶品类筛选

建立低密度脂蛋白受体(Low density lipoprotein receptor,LDLR)激动剂药物筛选模型,并用该模型筛选出具有上调LDLR功能的黑茶品类。合成LDLR启动子片端(189bp),克隆入含有萤火虫荧光素梅报告基因的p GL3-basic载体中,构建了重组报告基因质粒p GL3-LDLR,以p RL-TK为内参质粒,瞬时转染人肝癌细胞Hep G2;以降脂药物辛伐他汀作为阳性对照物,优化反应条件,再应用该模型对8种黑茶水提取物进行了初步筛选。结果表明,辛伐他汀对荧光素酶的表达具有较强的诱导作用,且呈一定剂量的依赖性,Z′因子为0.72,表明该模型具有很好的灵敏性和稳定性,成功地建立了靶向LDLR转录活性的双报告基因筛选体系,并发现待测黑茶均有一定的激动活性,其中金花天成茶对模型的激活值最高,激活值达1.761。