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61.
62.
将除去3'端跨膜区的猪瘟病毒E2基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,获得重组质粒pFBHT-E2,转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,发生转座作用,经抗性及蓝白斑筛选得到含E2基因的重组载体质粒rBacmid-E2,以脂质体介导的方法将此重组载体质粒转染sf9昆虫细胞,获得重组病毒,命名为rvBac-E2.经SDS-PAGE和Western-blot及ELISA等方法检测,结果表明,此E2基因在昆虫细胞中正确表达,表达的蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应. 相似文献
63.
根据环形泰勒虫TaA1272-1株裂殖体表面抗原(TaSP)基因的序列设计了1对引物,用PCR扩增出该基因长为393bp的高免疫原性区片段(SBxp)。将扩增产物连接到pGEM-T Easy载体上,转化入大肠埃希氏菌JM109中进行克隆。随后将重组质粒pGEM-SBxp和表达载体pGEX-4T-1分别以BamHⅠ、XhoⅠ酶切后,将酶切的目的片段SBxp亚克隆到原核表达载体中构建了重组表达载体pGEX-4T-1-SBxp,并将其转化到BL21宿主菌中。提取重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ酶切、PCR鉴定和测序确证后,阳性克隆用IPTG诱导表达。收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western blotting检测。结果,SBxp基因在大肠埃希氏菌中成功表达,其表达产物为分子质量43ku的融合蛋白,该产物能被牛环形泰勒虫阳性血清所识别。 相似文献
64.
phyA基因的克隆及其新型表达载体的构建 总被引:2,自引:0,他引:2
直接以黑曲霉菌株F246基因组为模板,对植酸酶基因phyA的成熟肽(分子长度为1347bp)进行了PCR扩增,再将PCR产物克隆入pMD18-T质粒,经DNA测序鉴定正确后,亚克隆入表达载体pET30a^ 和pMG36e,成功构建了phyA基因2种新型表达载体。植酸酶phyA基因2种新型表达载体的构建,为进一步获得大量、高活性植酸酶以及研究和开发新型微生态制剂打下了基础。 相似文献
65.
对从含有鸡毒霉形体H3株TM-1基因的大肠埃希氏菌DH5α中提取的质粒,进行EcoR Ⅰ和Sα/Ⅰ双酶切,获得了大约为786bp的目的片段。将此片段与经EcoRⅠ和Sαl Ⅰ双酶切的线性原核表达载体pET-30a-1连接。转化宿主菌BL21(DE3),筛选阳性克隆。提取质粒,经酶切、PCR扩增和测序分析确证其插入正确,从而构建成了重组表达载体。阳性克隆用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳分析,证明其分子质量约为29ku;Western-blotting分析表明,该蛋白可被鸡毒霉形体阳性血清识别,具有生物学活性。 相似文献
66.
根据已克隆的堆型艾美球虫(Eimeria acervulina)广东株子孢子表面抗原基因cSZ1的cDNA序列设计了特异性引物,用PCR方法扩增cSZ1的开放阅读框架(ORF)后克隆至表达载体pET-32a( ),构建了重组表达质粒pET-32a( )-cSZ1,并将其转化至大肠埃希氏菌BL21(DE3)。经IPTG诱导,获得了cSZ1重组抗原在大肠埃希氏菌中的高效表达,表达产物量可达菌体总蛋白的9.3%,融合蛋白的分子质量约为40ku。重组菌诱导表达的产物经SDS—PAGE后,用堆形艾美球虫感染鸡的超免疫血清进行免疫印迹分析,结果为阴性,提示cSZ1所编码的抗原可能主要是T细胞抗原表位。 相似文献
67.
以猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型25-4株基因组DNA为模板,PCR方法扩增外膜蛋白(OMP)5′末端保守区基因片段(OMPc),酶切及核苷酸序列分析鉴定后,与原核表达载体质粒pGEX-6P-1进行连接,构建成重组表达载体pGEX-OM-Pc,转入大肠杆菌BL21中,以IPTG进行诱导,SDS-PAGE电泳分析发现,转化了重组质粒的菌株所表达的融合蛋白相对分子量为34 kD,与实际预测相符,命名为GST-OMPc.GST亲和层析柱进行纯化,ELISA方法对纯化蛋白进行检测.结果表明:纯化蛋白GST-OMPc能够与兔抗猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型的阳性血清反应.OMPc蛋白的成功表达为其功能的研究打下基础. 相似文献
68.
马立克氏病病毒pp38基因启动子和增强子的克隆和序列分析 总被引:4,自引:0,他引:4
参考GeneBank发表的马立克氏病病毒(MDV)国际标准强毒株GA的基因序列,设计合成一对引物,分别以RBIB,814,GD2(广东分离株),J-1-E(北京分离株),Md11,Md5,CV1988等不同毒株的MDV基因组DNA为模板,通过PCR扩增,获得了预期大小的PCR产物。该产物经pGEM-T-easy克隆后测序,将所得序列进行比较分析。结果发现:不同毒株间pp38基因的启动子和增强子序列间有缺失突变,序列的同源性大于95.9%,其中大多数的突变发生在MDV复制的原点附近。 相似文献
69.
透明颤菌血红蛋白基因(vgb)在大肠杆菌中的高效表达 总被引:3,自引:0,他引:3
利用PCR技术将透明颠菌血红蛋白基因(vgb)克隆到融合表达载体pET28a,在大肠杆菌BL21(DE3)表达。重组蛋白在30℃诱导获得可溶表达。利用Ni^2+亲和层析对重组蛋白进行了纯化,得到重组的透明颠菌血红蛋白,蛋白呈红色。实验现象显示重组蛋白与血红索相结合。紫外光区和可见光区波长扫描分析显示:蛋白粗提物和纯化后的血红蛋白在230nm和413nm都有强吸收峰,初步表明,尽管重组蛋白比天然蛋白多36个氨基酸,重组蛋白仍然具有生理活性。诱导后4h和6h的培养液氨基乙酰丙酸含量分别达到17mg/L和21mg/L。说明重组蛋白的表达明显促进了体内heme合成途径。 相似文献
70.
根据克隆的毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)广东株微线蛋白-2基因(EnMIC-2(Gd))的cDNA序列设计特异性引物,用PCR方法扩增其阅读框架(ORF)后,克隆至质粒表达载体pET-32a( ),成功构建了重组表达质粒pET-32a( )-EnMIC-2。用CaCl2法将其转化至宿主细菌E.cliBL21(DE3),并用IPTG成功诱导了EnMIC-2重组抗原在大肠杆菌表达。表达的重组蛋白约占菌体总蛋白的10.8%,其相对分子质量约为55000。重组蛋白经SDS-AGE分析后,用E.necatrix(广东株)感染鸡的高免血清进行Western Blotting分析,结果为阳性。 相似文献