植物凝集素在植物保护中的研究进展

植物凝集素最早发现于1888年,Stillmark在蓖麻（RicinuscommunisL．）籽萃取物中发现了一种细胞凝集因子,它具有凝集红细胞的作用。它是一类具有特异糖结合活性的蛋白,具有一个或多个可以与单糖或寡糖特异可逆结合的非催化结构域。根据植物凝集素亚基的结构特征,植物凝集素分成4种类型：部分凝集素、全凝集素、嵌合凝集素、超凝集素;     

人基质蛋白酶2(MMP-2)血红素结合蛋白样结构域原核表达、复性及生物学活性验证

用RT-PCR从人神经胶质瘤U87细胞扩增人基质金属蛋白酶-2(MMP-2)血红素结合蛋白样结构域(PEX)基因,克隆到pMD18-T载体然后测序;将PEX定向克隆到PET-25b(+)中构建原核表达载体PET-PEX,转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达产生表达量近40%的包涵体蛋白,表达蛋白分子量大小约28.0 KD,与预期大小相符.包涵体经优化洗涤,8 mol/L尿素变性,采用透析法进行复性.鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)试验显示复性后的PEX蛋白能显著抑制鸡胚新生血管生成(P<0.05),并且其抑制作用表现出一定的剂量依赖性.     

RGA法标记植物抗病基因的研究进展

简述了植物抗病基因的结构特点,介绍了利用RGA法克隆的抗病基因同源序列及其应用,对RGA法的应用前景进行了展望。     

小麦ERF类转录因子W17的结合特异性及亚细胞定位分析

 【目的】构建ERF（ethylene-responsive element binding factor）转录因子基因W17的亚细胞定位载体和原核表达载体,验证W17是否具有核定位功能,阐明W17与GCC、DRE探针的体外结合特性,利用GUS瞬时表达系统分析W17蛋白的体内结合特性和转录激活功能,初步预测W17在植物胁迫信号传导途径中的作用。【方法】构建W17/163hGFP亚细胞定位载体,基因枪转化洋葱表皮细胞,暗培养24 h后共聚焦显微镜下观察。构建W17/pGEX-4T-1原核表达载体,转入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG（0.5 mmol•L-1,3 h）诱导,GST纯化柱纯化,纯化的融合蛋白与[γ-32P]ATP标记的GCC、DRE探针混合进行凝胶阻滞试验。构建GUS瞬时表达系统,通过农杆菌介导转化烟草,X-Gluc染色、酒精脱色后体视显微镜下观察。【结果】W17基因具有核定位功能,纯化的融合蛋白GST/W17能与正常GCC、DRE探针体外特异结合,与突变GCC、DRE探针不结合,在植物体内与GCC特异结合并能激活下游GUS基因表达。【结论】W17通过自身的NLS进入核内行使功能,参与了GCC-box调控的生物胁迫信号传导途径,还可能参与了非生物胁迫（盐胁迫）传导途径。     

猪δ冠状病毒RBD蛋白多肽抗体的制备与鉴定

【目的】设计合成猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)受体结合结构域(receptor binding domain, RBD)的抗原表位,制备并鉴定多克隆抗体。【方法】为了特异性检测PDCoV RBD抗原,应用生物信息学技术预测其潜在抗原表位,将表位氨基酸序列与δ冠状病毒属中的其他15株病毒株以及14株其他猪冠状病毒株进行相似性比对,将筛选的优势抗原表位与载体蛋白血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)偶联,合成多肽并免疫小鼠,制备PDCoV RBD特异性抗体。通过Western blotting试验对不同系统表达的PDCoV RBD以及PDCoV、TGEV和PEDV感染ST细胞表达的S蛋白进行鉴定,通过间接ELISA方法测定抗体效价。【结果】经序列比对,利用生物信息学技术预测合成的表位抗原与δ冠状病毒属中的其他15株病毒株(0～14.28%)以及14株其他猪冠状病毒株(0～7.14%)序列相似性非常低,具有良好的保守性;Western blotting结果显示,制备的多肽抗体1∶500、1∶1 000、1∶2 ...     

玉米BURP家族基因的鉴定和分析

利用玉米基因组数据库,通过生物信息学手段鉴定玉米BURP家族基因的全序列、定位和编码蛋白,通过序列比对进行进化和分类分析,利用玉米高通量芯片表达数据进行组织表达谱分析。结果表明,玉米基因组中含有10个BURP家族基因,分布于玉米的5条染色体上,该10个基因通过选择性剪切编码14个BURP蛋白。启动子分析表明,大部分BURP家族基因的启动子区均含有逆境应答及花粉和种子发育顺式作用元件。各个发育阶段中,多数成员在生殖器官及营养器官中均有较高的表达量,只有ZmBURP3仅在营养器官根、茎、叶中高表达,ZmBURP2仅在生殖器官雄蕊和花粉中高量表达。实时荧光定量PCR结果表明,ZmBURP3、ZmBURP4基因受PEG和NaCl胁迫处理诱导不同程度上调表达。     

拟南芥仅含START结构域亚家族基因特性与功能分析

【目的】分析拟南芥中仅含START结构域(the lipid/sterol-binding St AR-related lipid transfer protein domains)亚家族成员的启动子元件及表达特性,阐明启动子元件与表达特性的相互关系,为明确仅含START结构域亚家族的生物学功能,解析植物生长发育机理、更好地促控植物生长提供理论依据。【方法】利用生物信息学方法分析仅含START结构域亚家族6个成员的亲缘关系及各自启动子区所包含的所有元件,对启动子元件的功能进行分析和分类;利用real-time PCR方法研究亚家族成员的表达特性;用突变体分析确认基因的功能;分析通过启动子元件分析预测的基因功能与通过突变体分析确认的基因功能间的相关性,为基因的功能和作用机制分析提供科研思路和方法。【结果】生物信息学分析表明,拟南芥中仅含START结构域亚家族成员共6个,分为3个分支,每个分支一对基因,每一对基因中均有一个基因的启动子中含有高转录水平元件5′UTR Py-rich stretch,6个亚家族成员的启动子区均含有多个光、激素和逆境响应元件,也存在各自特异的响应元件;用real-time PCR分析基因的表达量,结果与生物信息学预测结果一致:At3g13062的表达量明显高于同分支的At1g55960,At3g23080的表达量明显高于同分支的At4g14500,At1g64720的表达量明显高于同分支的At5g54170。组织定位分析表明亚家族成员有特异的时空表达特性:At3g13062和At1g55960在幼苗期就有明显表达,但At3g13062主要在子叶、下胚轴和根中表达,而At1g55960主要在根中表达量较多;在成苗期拟南芥中,At3g13062主要在叶片中表达,在根中表达量较少;而At1g55960在成苗期拟南芥的叶片和根系的表达量均较多;At3g23080和At4g14500在幼苗期表达量较少,而在成苗期表达量增加,At3g23080主要分布于莲座叶中,At4g14500主要分布于莲座叶叶柄部。上述结果表明仅含START结构域亚家族成员可能在拟南芥不同时期和不同的部位分别行使着功能。利用生物信息学对启动子元件分析发现,各个基因均具有胚乳特意表达的Skn-1 motif元件,暗示着该家族基因可能参与调控胚乳的发育,进而影响种子的活力和萌发;通过对At3g23080和At4g14500的T-DNA插入突变体种子的分析表明,At3g23080和At4g14500表达量下降均会导致种子活力和萌发率的下降,这与生物信息学预测结果一致。【结论】拟南芥中仅含START结构域的亚家族有6个成员;6个亚家族成员可能在光、激素和逆境调控的发育过程中具有重要的作用;含START结构域的亚家族6个成员虽然同源关系较近,但具有各自的时空表达特性,在拟南芥的不同组织和不同发育时期执行着各自的功能。基因启动子元件与基因功能有直接关系,启动子区具有胚乳特意表达Skn-1 motif元件的At3g23080和At4g14500表达量下降均会导致种子活力和萌发率下降。     

红螯螯虾卵黄蛋白原N端结构域的生物信息学分析与蛋白的表达鉴定

为研究红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)卵黄蛋白原N端结构域(vitellogenin N domain, VitN)的生物学功能并获得具有免疫特异性的红螯螯虾VitN融合蛋白,试验根据红螯螯虾卵黄蛋白原的mRNA序列(GenBank登录号为AF306784.1)获得VitN mRNA序列(编码第42～585位氨基酸),通过在线分析工具对红螯螯虾VitN进行生物信息学分析,并优化合成红螯螯虾VitN基因序列,构建重组表达质粒pET-28a-VitN,将其转化至大肠杆菌BL21(λDE3)感受态细胞中,经IPTG诱导,对红螯螯虾VitN融合蛋白进行表达、纯化、包涵体复性、Western-blot鉴定和浓度测定。结果表明：编码红螯螯虾VitN的氨基酸共544个,均为常见氨基酸,其中丙氨酸、缬氨酸和丝氨酸含量较多(占比分别为7.72%、7.72%和7.54%),色氨酸含量最少(仅占0.92%);红螯螯虾VitN的相对分子质量为64 681,理论等电点为8.69,共含有8 540个原子,分子式为C₂₆₇₁H₄₂₆₀N_7...     

橡胶树HbFCA启动子在转基因烟草中的功能缺失分析

利用5′缺失设计一系列引物,扩增HbFCA启动子质粒,获得5个启动子缺失片段,用这些片段分别替换PBI121载体中的CaMV35S启动子,得到5个HbFCA的5′缺失表达载体,即pA、pB、pC、pD和pE。利用农杆菌介导叶盘法进行烟草遗传转化,对组培瓶内生根较好的烟草叶片GUS染色,结果发现,长度为最小片段的276 bp的pE可以较好地实现HbFCA启动子的功能。对橡胶树体细胞胚瞬时表达检测发现,pE片段也能启动表达,有较好的GUS活性,可以实现HbFCA启动子的功能。     

鹅坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅲ的原核表达及抗原性分析

[目的]获得鹅坦布苏病毒(GTMUV)E蛋白结构域Ⅲ的原核表达重组蛋白并明确其免疫原性,为进一步研究其生物学功能及研制亚单位疫苗奠定基础.[方法]根据GenBank中GTMUVJS804株E蛋白结构域Ⅲ的同源基因序列设计1对引物,在其两端加入Flag标签序列和酶切位点,采用PCR扩增GTMUV的E蛋白结构域Ⅲ基因(EⅢ),然后与pET32a原核表达载体连接构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21 (DE3)后用IPTG诱导融合蛋白表达,并以Westernblotting鉴定其免疫原性.[结果]PCR扩增获得携带Flag标签序列的EⅢ基因片段约430 bp,将其插入pET32a载体可成功构建重组质粒pET32a-EⅢ.阳性重组菌经IPTG诱导表达5h即可得到融合蛋白,分子质量约33.0 kDa,主要以包涵体形式存在.Westem blotting鉴定结果显示,融合蛋白与抗Flag标签单克隆抗体、小鼠抗坦布苏病毒多克隆抗体均可发生特异性反应,检测到预期的目的条带.[结论]GTMUV E蛋白结构域Ⅲ能在大肠杆菌中成功诱导表达,且获得的融合蛋白具有良好的免疫原性,可用于研制GTMUV诊断抗原和亚单位疫苗.