微孢子虫O-甘露糖糖基化通路相关酶基因序列的比较分析

糖蛋白在免疫识别、信号转导等生命进程中扮演重要角色。为研究微孢子虫糖蛋白及其糖基化类型,采用比较基因组学方法对微孢子虫O-甘露糖糖基化通路进行分析。真核生物的O-甘露糖糖基化通路中有6种主要酶类,包括己糖激酶、磷酸甘露糖酶、GDP甘露糖磷酸化酶、Dol-P甘露糖合成酶、甘露糖转移酶、Dol-P甘露糖蛋白甘露糖转移酶。通过生物信息学方法分析家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)、蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)、兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)、肠脑炎微孢子虫(Encephalitozoon intestinalis)、比氏肠道微孢子虫(Encephalitozoon bieneusi)和柞蚕微孢子虫(Nosema antheraea)的这6种酶基因编码氨基酸序列特征及结构域类型,发现这些酶的垂直同源基因比较保守,多重序列比对表明在6种微孢子虫之间,6种酶的氨基酸序列相似性比较高,系统进化分析显示同属的微孢子虫多聚为一簇。研究结果表明,N.bombycis、N.ceranae、E.cuniculi、E.intestinalis和N.antheraea 5种微孢子虫的O-甘露糖糖基化的蛋白质修饰通路是完整、保守的,然而在E.bieneusi中,其关键酶Dol-P甘露糖蛋白甘露糖转移酶的氨基酸序列比较短,只有342个氨基酸,缺失了关键结构域PMT,因此可能无法完成O-甘露糖糖基化修饰。以上微孢子虫的O-甘露糖糖基化通路中6种主要酶的序列信息,为后续解析家蚕微孢子虫糖基化通路及对糖蛋白糖基化类型与功能的研究提供了线索。     

家蚕Osiris基因家族成员的系统进化与组织表达芯片分析

昆虫特有基因对于维持昆虫特有的形态、行为及生活习性起关键作用,同时也是防治有害昆虫的靶标基因。基于家蚕基因组数据,对昆虫特有基因Osiris(Osi)家族进行了分析。通过同源比对,发现家蚕的Osi家族含有22个成员,其中21个基因串联分布在26号染色体,1个基因位于4号染色体。共线性分析发现,家蚕与黑腹果蝇有18个Osi基因表现为共线性关系。系统进化分析表明Osi基因家族是在昆虫物种分化前已形成的多基因家族,家蚕与果蝇的Osi家族亲缘关系相对较近。家蚕的4个Osi基因(BmOsi9-1、BmOsi9-3、BmOsi9-4和BmOsi9-5)聚成一个进化枝,且在基因组上呈串联分布,暗示其是在物种分化后通过基因复制产生的,属特有基因。结构域分析发现,家蚕Osi蛋白均含有一个功能未知的结构域DUF1676,是Osi基因家族的典型特征。组织芯片分析表明,BmOsi20和BmOsi17分别在家蚕5龄幼虫的中肠和精巢中特异性高量表达,BmO-si18和BmOsi9-1分别在马氏管和丝腺中特异表达。     

微小隐孢子虫LCCL结构域基因的克隆及原核表达

为探讨微小隐孢子虫的入侵机制,克隆、表达了微小隐孢子虫LCCL结构域基因。从已构建的微小隐孢子虫cDNA文库中,采用PCR随机扩增LCCL结构域基因。与Pmd-18-T载体连接后,挑取阳性重组子测序分析。用基因重组技术将LCCL结构域基因克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建LCCL结构域基因的重组原核表达载体pGEX-4T-1-LCCL。重组质粒经酶切、测序鉴定后转入大肠埃希菌BL21中,IPTG诱导表达目的蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。最终得到了在大肠埃希菌中高效表达的重组蛋白,分子质量大小约为37ku,并且具有反应原性,为进一步研究微小隐孢子虫的入侵机制奠定了基础。     

凡纳滨对虾C型凝集素（LvLc1）的特征和活性分析

C型凝集素是一种依赖于Ca~(2+)而发挥功能的糖蛋白,在一线的固有免疫防御过程中发挥着重要作用。围绕对虾C型凝集素开展深入研究,不仅可以丰富无脊椎动物固有免疫学内容,还有望将其开发为具有免疫增强效果的活性饵料,应用于对虾的健康养殖。本实验根据实验室前期转录组信息提示克隆获得了凡纳滨对虾一种新的C型凝集素基因(LvLc1,Gen Bank注册号:KY937940)。生物信息学分析显示LvLc1基因的开放阅读框全长891 bp,编码296个氨基酸,该基因编码的蛋白质含有一个保守的糖识别结构域(carbohydrate recognition domain,CRD),该结构域中具有潜在的半乳糖结合位点(QPD motif),进化发生分析显示LvLc1与来自节肢动物的甘露糖结合凝集素家族成员聚类在一起。对LvLc1基因的CRD结构域进行了原核重组表达与蛋白活性分析研究,结果显示:重组目的蛋白(rLvLc1)在Ca~(2+)存在的条件下,对多种病原菌(G~+、G~–和真菌)具有凝集作用,其凝集活性可被半乳糖、甘露糖、脂多糖等多种病原相关分子模式所抑制。研究表明,LvLc1作为C-型凝集素家族一个新成员,可能通过重要的模式识别受体作用,参与机体应答病原微生物侵染的防御过程。     

三角帆蚌EFCB1基因cDNA序列克隆及表达研究

为了发掘更多三角帆蚌具有EF-hand结构域的功能基因及其蛋白质,本研究运用RACE-PCR技术,克隆得到了三角帆蚌包含EF-hand结构域钙结合蛋白1基因(EF-hand calcium-binding domain-containing protein 1,EFCB1)的cDNA全长并进行了生物信息学分析;通过real-time Q-PCR技术,分析了EFCB1基因在三角帆蚌10个组织,以及内脏团、外套膜插核后不同时间点的时空表达特点。结果表明三角帆蚌EFCB1基因cDNA序列全长981 bp,ORF为531 bp,编码176个氨基酸残基,5'-UTR 239 bp和3'-UTR 211 bp。EFCB1分子式为C₈₇₇H₁₃₄₈N₂₃₈O₂₇₀S₁₀,分子量约19.9 ku,等电点为4.70,不稳定系数为62.65,属亲水蛋白。其序列无信号肽序列,存在1个跨膜区域和2个EF-hand结构域,EF-hand模块分别为DLNDDKLISPEE(98-109)和DTNGDDKLDGEE(129-140)。荧光定量结果显示三角帆蚌EFCB1基因在各组织中均有表达,其中在肠和鳃中表达量最高(P<0.05),外套膜中表达量显著高于内脏团(P<0.05)。EFCB1基因在插核后不同时期的外套膜和内脏团育珠部位组织中表达具有显著差异(P<0.05),在外套膜中的表达量均显著高于内脏团(P<0.05),在插核后第20 天时表达量显著高于各时期(P<0.05)。研究表明,EFCB1在三角帆蚌Ca²⁺的吸收过程中发挥调节作用,在珍珠囊形成过程中以及珍珠形成初期具有重要功能。     

丙酮丁醇梭菌钙离子结合蛋白多样性研究

为了探讨钙离子对产溶剂梭菌的影响,通过生物信息学方法对丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824进行蛋白质组学分析,预测可能存在的钙离子结合蛋白(calcium binding proteins,CaBPs)。利用EF手型(EF-hand)、希腊钥匙(Greek key)、β桶状结构(β-roll)、免疫球蛋白质类似蛋白质(Big-like)结构域基序预测丙酮丁醇梭菌蛋白质组中含有钙离子结合区域的蛋白质,建立本地BLAST数据库,通过GO和KEGG数据库分析所预测到的蛋白质。研究最终预测出228个含有相关位点的蛋白质,利用GO注释在生物过程、细胞组分和代谢过程对蛋白质进行了功能分类。KEGG代谢通路分析表明,该类蛋白质主要参与代谢途径、生物抗性基因合成、次级代谢物生物合成和信号传导等过程。     

中国明对虾C 型凝集素基因(Fclectin)的重组表达及活性分析

研究拟通过分析对虾C型凝集素的活性特点,探讨其在对虾先天免疫应答过程中的潜在功能以及在养殖生产实践中的应用。实验利用原核表达系统对中国明对虾C-型凝集素基因的两个串联的糖识别结构域(carbohydrate recognition domain,CRD)进行了重组表达,并通过纯化复性获得了重组目的蛋白(rFclectin-CRD1和rFclectin-CRD2)。活性分析结果显示,重组目的蛋白对多种病原菌有凝集和抑制生长的作用,并且具有Ca2+依赖活性;其凝集活性可被半乳糖、肽聚糖、脂多糖等多种病原相关分子模式所抑制,研究结果证实,Fclectin是一种典型的C-型凝集素,它可能作为中国明对虾先天免疫中重要的模式识别受体,在一定程度上参与了机体应答病原微生物的防御过程。     

广西眼镜蛇Dmrt基因DM结构域克隆及序列分析

[目的]了解广西眼镜蛇Dmrt基因DM结构域特性,为探讨眼镜蛇性别决定和分化发育的分子机制及证实Dmrt基因家族在爬行动物进化中的保守性提供理论依据.[方法]以广西眼镜蛇为材料,采用简并PCR扩增克隆眼镜蛇Dmrt基因DM结构域,并分析其与人、猕猴、牛、小鼠、大绿蛙、中华蟾蜍、扬子鳄等相应Dmrt基因DM结构域的同源性及系统进化关系.[结果]克隆获得广西眼镜蛇Dmrt基因家族的两个成员,分别命名为Nn1 Dmrt和Nn2 Dmrt.经系统进化分析,发现两个Dmrt基因DM保守区核酸序列与人、猕猴、牛、小鼠、大绿蛙、中华蟾蜍、扬子鳄相应Dmrt基因保守区核酸序列的相似性均在74%以上,其推导氨基酸序列的相似性均在80%以上.[结论]Dmr基因DM结构域编码序列在不同物种中同源性较高,Dmrt基因家族在动物系统进化上具有高度的保守性.     

大豆TCP转录因子家族结构域分析及功能预测

利用已知的拟南芥TCP基因和大豆基因组数据库,通过生物信息学方法,鉴定并获得了大豆TCP家族基因序列,基因定位信息。共鉴定大豆TCP基因54个,分布在大豆除14号染色体外的其他19条染色体上。对54个基因进行进化和聚类分析及功能结构域的分析,发现全部具有高度保守的TCP结构域。根据结构域差异和系统发育分析的结果,将大豆TCP转录因子家族分成2个TCP亚家族。以生物信息学手段和已有的其他物种的TCP基因进行了比较分析,大豆TCP基因占总数的3.5%,与拟南芥同源基因比较,序列长度存在相似性。对启动子元件分析显示,TCP基因含有大量与在子叶、根、茎处大量表达有关的元件及对分生组织有作用的元件。     

植物凝集素在植物保护中的研究进展

植物凝集素最早发现于1888年,Stillmark在蓖麻（RicinuscommunisL．）籽萃取物中发现了一种细胞凝集因子,它具有凝集红细胞的作用。它是一类具有特异糖结合活性的蛋白,具有一个或多个可以与单糖或寡糖特异可逆结合的非催化结构域。根据植物凝集素亚基的结构特征,植物凝集素分成4种类型：部分凝集素、全凝集素、嵌合凝集素、超凝集素;