沙冬青AmCSDP基因特性及转基因烟草的抗寒性分析

冷休克结构域蛋白(CSPs)是含有不同数量冷休克结构域(cold shock domain,CSD)的低温响应蛋白,在低温胁迫中发挥重要作用。以沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)为材料,克隆得到了冷休克结构域蛋白基因AmCSDP。生物信息学分析显示AmCSDP(Gen Bank登录号:KX756575)全长540bp,编码180个氨基酸,二级结构由8.9%的α–螺旋、47.8%的β–折叠和43.3%的无规则卷曲组成,其N端含有冷休克结构域。进化分析表明沙冬青与花生同源性最高。构建了AmCSDP真核表达载体Pcambia2300-35S-AmCSDP-OCS,经农杆菌介导转入本氏烟中。对转基因T1代和野生型烟草进行4℃低温胁迫处理,结果证实转基因本氏烟比野生型的耐冷能力强。     

作物驯化和品种改良所选择的关键基因及其特点

近15~20年作物基因组学迅速发展,特别是第2代测序技术的普及,显著降低了测序成本,使单核苷酸多态性(SNP)分析和单元型区段(也称单倍型区段)分析渗透到生命科学的各个领域,对系统生物学、遗传学、种质资源学和育种学影响最为深刻,使其进入基因组学的全新时代。一批驯化选择基因的克隆,特别是对一些控制复杂性状形成的遗传基础及其调控机制的解析,更清晰地揭示了作物驯化和品种改良的历史,提升了人们对育种的认知,推动育种方法的改进。驯化和育种既有相似之处,也存在明显的差异。驯化选择常常发生在少数关键基因或位点,对基因的选择几乎是一步到位;而现代作物育种虽然只有100年左右的历史,但其对基因组影响更为强烈,是一些重要代谢途径不断优化的过程。随着生态环境或栽培条件的变化,育种选择目标基因(等位变异)会发生相应的变化或调整,因此对基因(等位变异)的选择是逐步的。此外,强烈的定向选择重塑了多倍体物种的基因组,使其亚基因组与供体种基因组明显不同。在群体水平上,系统分析驯化和育种在作物基因组和基因中留下的踪迹,凝炼其中的规律,将为品种改良和育种提供科学理论和指导,本文也简要介绍了"十三五"国家重点研发计划专项"主要农作物优异种质资源形成与演化规律"的基本研究思路。     

水、旱条件下小麦苗期部分农艺性状的遗传分析

为研究水分胁迫对小麦幼苗部分农艺性状的影响,分析这些性状与干旱胁迫的关系。以‘青麦6号’和‘烟农24’杂交形成的F2:3群体为材料,采用主基因+多基因混合遗传模型对其进行遗传分析。水、旱2种条件下,根长和根鲜重均为1对加性-显性效应主基因模型;茎鲜重、茎干重、根干重、根茎鲜重比和根茎干重比的最适遗传模型不同。干旱胁迫条件下,茎鲜重主基因遗传率为37%,茎干重、根长、根鲜重、根干重、根茎鲜重比及根茎干重比主基因遗传率分别是51%、81%、74%、56%、50%、68%。茎鲜重、茎干重、根干重等性状,尽管检测到主基因,但在水旱条件下遗传模型不同,可进一步研究其遗传规律。     

冬小麦品种干旱胁迫后的恢复能力与水分利用效率的关系

为探讨营养生长期干旱胁迫-复水后的恢复力作为品种群体水平水分利用效率(WUE)鉴定指标的可能性,以冬小麦品种‘晋麦47’和‘京411’及其34个近等基因系为材料,利用半自动防雨棚与渗漏池开展模拟干旱实验,于拔节初期干旱较严重时复水,测定复水后的生物量积累作为恢复力,同时测定营养生长期末的株高以及品种/系的群体WUE,分析材料之间恢复力、株高、和群体WUE之间的差异,以及恢复力与群体WUE之间的相关性。结果发现,部分冬小麦品种/系之间恢复力达到显著差异,恢复力受基因型和生长环境共同影响,并且两者存在一定程度的互作。34个近等基因系与亲本在株高和群体WUE上均存在显著差异,品种/系的恢复力与株高之间呈显著的正相关关系,恢复力与株高分别与群体的产量水平的WUE呈极显著正相关关系。该研究结果初步表明,胁迫-复水后的恢复力可以作为品种在干旱条件下群体WUE鉴定评价的指标。     

基于“多基因聚合-早世代组配”策略的水稻分子改良研究

传统水稻育种技术最主要瓶颈是选择效率低和周期长。为了提高水稻优异材料选育和杂交稻组配效率,创新水稻分子育种策略,利用分子标记辅助选择多基因聚合和早世代杂交组配,展开水稻恢复系分子改良和杂交新组合的调查评价。供体亲本H318与恢复系亲本华占进行杂交,通过选择和设计关键有利基因的分子标记,利用毛细管电泳基因分型技术,将Wxb、fgr、Xa23、Pi2、Pi46以及Pita 6个稻米品质、香味、抗白叶枯病和抗稻瘟病相关功能基因进行聚合利用。通过多世代的田间生物学性状调查,米质、抗性等表型鉴定,获得14份以恢复系华占为遗传背景,目标基因纯合的优质、双抗和香型稳定的水稻株系。依据材料稳定遗传特性,将改良后代株系与生产应用的不育系进行测配和组合的调查评价,筛选获得潜在优良杂交稻。在育种进程中采用"多基因聚合-早世代组配"策略,实现多个有利基因快速聚合,定向改良稻米品质和抗病性等关键性状,并且促进杂交水稻组合的高效选育。     

利用CRISPR/Cas9技术创建OsCOL9水稻突变体

CRISPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行有效定点编辑,为作物的遗传育种提供了新的方向。以感病水稻品种丽江为材料,抗病基因OsCOL9为靶基因,探索该系统对水稻内源基因定点编辑效率以及获得有研究意义的突变体。OsCOL9基因CDS序列全长1 266 bp,编码一个422 aa蛋白,分子量大小约为45.6 k Da,蛋白质结构的N端含有B-box结构域,C端含有CCT(CONSTANS、CONSTANS-Like、TOC1)结构域。设计4个长20 nt的guide RNAs(gRNAs)靶点,靶向编辑OsCOL9基因的CDS起始区域以及外显子的末端,分别由U3、U6a、U6b以及U6c启动子驱动,提取T1转基因植株的基因组DNA并对编辑位点附近的DNA片段进行序列分析。结果表明,T1材料中OsCOL9的碱基缺失数最多可达59 bp,突变次数最多可达11次,取得较好的基因编辑效果。同时本试验出现了脱靶效应,因此着重探讨了降低脱靶效应的方法。由于CRISPR/Cas9系统在进行基因编辑时没有外源基因的导入,加上该技术的快捷、简便,对生物技术与传统育种的结合具有重要实践意义。     

大豆GmWRI1a基因启动子克隆及序列分析

以大豆基因组文库Phytozome公布的大豆Williams82基因组序列为参考,应用Primer Premier 5.0软件设计引物,用PCR技术扩增了大豆GmWRI1a基因的启动子序列,构建了重组克隆载体pGM-TpGmWRI1a,并通过PCR扩增对阳性克隆进行鉴定送测序。克隆获得GmWRI1a基因启动子序列1 686bp,该启动子序列除含有必需的起始转录位点、TATA-box、CTTA-box外还包含多个顺式作用元件,如光应答元件、赤霉素应答元件、表达分生组织相关元件、抗旱诱导元件等。同时,构建了该启动子植物表达载体pBI-pGmWRI1a,通过PCR扩增、限制性酶切对阳性克隆进行了鉴定,为启动子的功能研究奠定基础。大豆GmWRI1a基因启动子克隆与序列分析,将为进一步研究大豆GmWRI1a基因的表达调控及其功能分析提供参考。     

稻瘟病菌F-box蛋白MoFbr7生物学功能分析

F-box蛋白在泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)中参与调控胞内蛋白降解、受体识别、信号传导等生物学过程。本研究从稻瘟病菌中克隆了F-box基因MoFbr7,序列分析表明,该基因编码产物具有1个F-box结构域(N-端)和8个连续的WD40重复序列(C-端),在丝状真菌中高度保守。利用基因敲除方法,获得4个MoFbr7基因敲除突变体,同时构建了回补菌株。表型分析结果显示,MoFbr7基因缺失突变体在产孢量、附着胞形态、原生质体释放、致病性等方面均无异常。突变体在MM、RDC培养基上生长速率下降;对细胞壁胁迫因子CFW(Calcofluor white)、刚果红敏感。以上结果表明MoFbr7参与稻瘟病菌的营养生长与细胞壁完整性,为进一步揭示其生物学功能奠定基础。     

云南省元阳县籼/粳型稻瘟病菌无毒基因Avr-Pia、Avr-Pita1和Avr-Pii多样性分析

为明确云南省元阳县籼/粳型稻瘟病菌中无毒基因的多样性及差异,采用接种鉴别品种方法和PCR技术对9株粳型菌株和21株籼型菌株中无毒基因Avr-Pia、Avr-Pita1和Avr-Pii的多样性进行分析。结果显示,30株稻瘟病菌菌株中无毒基因Avr-Pia、Avr-Pita1和Avr-Pii的平均出现频率分别为33.3%、76.7%和0,Avr-Pia、Avr-Pita1在籼型菌株和粳型菌株中的出现频率分别为4.8%和100.0%、66.7%和100.0%。Avr-Pia主要为存在/缺失的多样性,籼/粳型菌株对水稻品种Achiasahi(Pia)的致病率分别为100.0%和11.1%;Avr-Pita1可划分为3个类群,除菌株CH1195属于PO类群外,籼型菌株均属于J1类群,粳型菌株则属于J2/J3类群;籼/粳型菌株对水稻品种K1(Pita)的致病率分别为100.0%和0,且籼/粳型菌株Avr-Pita1蛋白序列在第83位和第192位氨基酸差异明显。Avr-Pii在30株稻瘟病菌菌株中均未检出,籼/粳型菌株对水稻品种Fujisaka No. 5(Pii)的致病率分别为100.0%和0。表明Avr-Pia和Avr-Pita1在粳型菌株中的出现频率高于籼型菌株且变异程度低,粳型菌株中可能存在其它无毒基因使其不能侵染Fujisaka No. 5。     

韭菜迟眼蕈蚊紫外敏感视蛋白基因的克隆及光强度对其表达量影响

为明确韭菜迟眼蕈蚊Bradysia odoriphaga紫外敏感视蛋白基因Bo-uv的作用及其与趋光性的关系,利用常规PCR方法克隆获得Bo-uv基因的全长cDNA序列,分析了其敏感视蛋白的氨基酸序列与其它12种昆虫同源蛋白氨基酸序列之间的系统进化关系,运用qPCR技术检测了不同发育阶段、不同组织及不同光强度下Bo-uv基因的相对表达量。结果表明,Bo-uv基因cDNA全长2 757 bp,开放阅读框1 542 bp,编码514个氨基酸。韭菜迟眼蕈蚊紫外敏感视蛋白的氨基酸序列与其它12种昆虫同源蛋白的氨基酸序列一致性为21.93%～43.00%,与橘小实蝇Bactrocera dorsalis的氨基酸序列同源性最高。Bo-uv基因在韭菜迟眼蕈蚊蛹末期、成虫期表达,在成虫头部的相对表达量较高。在0～10 000 lx光强范围内雌、雄成虫体内该基因的相对表达量均呈先增高后降低趋势。与对照相比,1 000 lx光强度下其相对表达量显著升高,10 000 lx时相对表达量显著降低。表明光强度能够有效地调控Bo-uv基因的表达,该基因在韭菜迟眼蕈蚊感知外界光刺激过程中具有重要作用。