香蕉条斑病毒LAMP快速检测方法的建立

 环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是一种特异、灵敏、快速的新型基因检测技术。本研究以香蕉条斑病毒（Banana streak virus,BSV）ORF3保守区域为基础针对6个特定区域设计并筛选了4条LAMP扩增引物,通过对LAMP反应中MgSO₄、dNTPs、Betaine等主要试剂浓度进行优化,建立了香蕉BSV的LAMP检测方法,63℃反应90 min后通过在反应产物中添加SYBR Green Ⅰ染料后颜色的变化,肉眼即可判断检测结果。LAMP具有极高的检测特异性和灵敏性,其检测下限约为3.2 ng·μL^-1,是PCR检测灵敏度的25倍,能快速、准确地对疑似样品进行检测,本研究对华南地区部分疑似样品的检测结果显示LAMP阳性检出率比PCR检出率高。本文建立的BSV LAMP检测方法是对BSV检测方法的拓展和延伸,为香蕉病毒的快速检测提供技术保障。     

油菜茎基溃疡病菌LAMP-HNB 检测方法的建立

油菜茎基溃疡病菌是油菜上最严重的真菌病害之一,是我国重要的检疫性有害生物。因此为防范其危害我国油菜产业生产安全,建立油菜茎基溃疡病菌的快速筛查方法具有重要意义。基于环介导等温扩增法(LAMP),以ITS(内转录间隔区)为靶序列并结合指示剂羟基萘酚蓝(HNB)建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的油菜茎基溃疡病菌的快速检测方法,并对其特异性、灵敏性进行评价以及实际样品进行检测。结果显示,该方法在62℃等温条件下仅需80 min即可通过肉眼直接目测试验结果。LAMP-HNB法与标准PCR检测方法对比显示其具有良好的特异性以及更高的灵敏度,利用该方法对10批油菜籽样品进行检测,共检出5批阳性样品,与标准中PCR检测方法结果一致。该方法的建立为油菜茎基溃疡病菌的检疫鉴定提供了新途径。     

基于环介导等温扩增技术检测雪松疫霉根腐病菌

雪松疫霉根腐病菌(Phytophthora lateralis Tucker et Milbrath)是一种重要的毁灭性植物病原菌,也是我国进境植物检疫性有害生物。目前,我国未有该病害发生的报道,为了防止P.lateralis的传入和扩散,需对其进行快速、准确的检测。本文利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),以Ypt1基因为靶标序列,设计LAMP特异性引物,建立LAMP反应体系,并对灵敏度和特异性进行检测。结果表明:整个检测过程仅需80 min,即可通过肉眼观察直接判定检测结果。在特异性检测中,P.lateralis菌株都能观察到天蓝色的阳性反应,而其他疫霉菌和真菌供试菌株均呈阴性反应。在灵敏度检测中,最低检测限为100 pg/μL。该方法的建立为P.lateralis的检疫鉴定及其所致病害的快速诊断提供了新技术。     

石英砂-腐殖酸-Cupriavidus gilardii CR3复合体对铜离子的吸附特性及机理研究

[目的]研究pH、初始铜离子浓度和吸附时间对石英砂-腐殖酸-Cupriavidus gilardii CR3复合体吸附铜离子的影响。[方法]利用等温吸附模型和动力学模型拟合试验数据,通过测定复合体吸附铜离子前后的Zeta电位、扫描电子显微镜-能谱(SEM-EDS)和傅里叶红外光谱(FTIR),研究吸附剂对铜离子的吸附特性及机理。[结果]pH是影响吸附能力的主要因素,静电作用可使复合体表面负电荷增多,提高吸附量。在最适pH(5.0)下,复合体对铜离子的最大吸附量为13.08 mg/g。复合体对铜离子的吸附过程符合化学单分子吸附的Langmuir模型和二级动力学模型。[结论]该研究认为静电作用和单分子化学吸附是石英砂-腐殖酸-Cupriavidus gilardii CR3复合体吸附铜离子的主要机制。     

Establishment and Application of Loop-mediated Isothermal Amplification for Rapid Detection of Porcine Epidemic Diarrhea Virus

This study was aimed to establish a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for detection of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), and provide a simple, sensitive, accurate and reliable tool for diagnosis of PEDV.The conservative PEDV N gene (GenBank accession number: KT799997) of PEDV was selected as a target to design six specific primers.The reaction system and temperature of LAMP were optimized, and the LAMP method for specific amplification of PEDV was established. Results showed that the PEDV LAMP detection method was established successfully, and it could detect PEDV specifically at 60℃ for 60 min,and the detection limit was 91 copies/μL, which was one hundred-fold higher than conventional RT-PCR method.75 clinical samples were detected by LAMP and PCR, respectively, the coincidence of LAMP and PCR was about 97.3%. All the data suggested that the LAMP assay had strong specificity, high sensitivity, simple operation, low equipment requirement, and was suitable for rapid detection of PEDV clinical samples.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

为建立一种快速、灵敏、简便的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）早期检测方法,本研究利用逆转录环介导恒温扩增技术（RT-LAMP）,针对PRRSV的ORF5基因片段设计了4条引物,利用Bst DNA聚合酶在65 ℃恒温条件下进行逆转录扩增,通过1.0%琼脂糖凝胶电泳和加入SYBR Green Ⅰ染料肉眼判断结果,建立了PRRSV RT-LAMP检测方法。结果表明,该检测方法具有良好的特异性,与其他常见病毒如猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒等无交叉反应,较普通RT-PCR灵敏性高100倍。采用RT-LAMP和RT-PCR分别对10份临床样本同时进行检测,符合率为100%。因此,本研究建立的RT-LAMP是一种可适用于临床PRRSV检测的快速、简单、灵敏、特异的检测方法。     

钾细菌对钾长石胶体吸附特性的影响研究

土壤硅酸盐细菌能够分解含钾硅酸盐矿物,可有效缓解我国农田土壤有效钾不足的问题.对硅酸盐细菌与含钾矿物表面的交互作用的研究有助于了解土壤硅酸盐细菌解钾的作用机制与效率.选取硅酸盐矿物钾长石和硅酸盐细菌,通过DLVO理论和扩展DLVO理论分别计算出钾长石胶体体系、钾长石-钾细菌混合体系颗粒间的相互作用力,探讨钾细菌对钾长石胶体吸附特性的影响.研究结果表明:钾长石-钾细菌混合体系对亚甲基蓝的吸附量明显大于钾长石对亚甲基蓝的最大吸附量.细菌比表面积大,加入钾长石胶体中,形成的钾长石-钾细菌复合物的比表面积增大,导致钾长石-钾细菌混合体系吸附反离子的能力增大,屏蔽电场的强度增强,静电斥力减弱,吸引力增加,从而提高了吸附强度.     

DNA在黑土胶体微界面的吸附与解吸特性

为了揭示DNA在黑土微生物的遗传进化和基因转移机制方面的重要意义,采用平衡法研究了含有机质黑土胶体(Coarse organic colloid,COC)和去有机质黑土胶体(Coarse inorganic colloid,CIC)对DNA的吸附与解吸特性。结果表明:CIC在快速吸附期吸附DNA的速率和数量都小于COC,且更快达到吸附平衡;随着pH值升高,黑土胶体表面吸附DNA数量逐渐减少;Langmuir吸附方程可较好地描述COC和CIC对DNA的等温吸附,COC和CIC的决定系数(R~2)分别为0.972和0.991,且COC的吸附平衡常数(K)大于CIC,说明COC对DNA的吸附亲和能力大于CIC;CIC和COC表面DNA的解吸率分别为63.5%和47.4%。研究结果证明,有机质在黑土胶体吸附DNA的数量和亲和力方面贡献较大,pH是影响黑土胶体吸附DNA的重要因子。     

环介导等温扩增技术快速检测大西洋鲑的研究

为探究环等温扩增技术(LAMP)在鲑科鱼类物种鉴定方面的应用,以大西洋鲑为研究对象,针对其线粒体CR区段设计特异性的LAMP引物,并通过单因素试验和正交试验研究反应体系中d NTP Mix、Mg~(2+)、甜菜碱终浓度对LAMP扩增结果的影响。结果表明,大西洋鲑LAMP扩增的最优条件为:引物SS-CR-F3/SS-CR-B3各0.2 m M,SS-CR-FIP/SS-CR-BIP各1.6 m M,dNTP Mix 1.4 m M,Mg~(2+)6 m M,甜菜碱0.8M,Bst DNA聚合酶8 U,扩增温度为65℃,反应时间60 min。在此条件下LAMP扩增产物电泳检测特异性强、稳定性好,对大西洋鲑DNA的检出限达0.01 ng·μL~(-1),并可对混合样本进行检测。本研究结果为大西洋鲑快速物种鉴定提供了一种重要技术手段,该技术可应用于鲑科鱼类物种鉴别的日常检验检疫和市场监管工作中。