家蚕Ring基因的克隆及序列特征与组织表达分析

Polycomb group(PcG)蛋白是多细胞有机体中的一类表观遗传抑制因子,Ring是Pc G蛋白家族的主要成员,在Pc G蛋白的转录抑制调控中行使重要功能,对昆虫和哺乳动物的发育至关重要。利用同源检索方法获得家蚕Ring基因(BmRing)的核苷酸序列,该基因位于家蚕第17号染色体的nscaf2865位点。BmRing的核苷酸序列由4个外显子和3个内含子构成,基因的c DNA3'端有2个多聚腺苷酸化信号(aataaa)和典型的poly(A)结构;BmRing编码由377个氨基酸组成的蛋白质,分子质量为41.8 k D,等电点为6.72,氨基酸序列具有3个同源异型结构域(homeobox domain,HD),46~85 aa为高度保守的典型的环指结构域(Ring finger),331~347 aa为跨膜区,N端位于膜外。通过STRING在线预测分析得到10个与BmRing有相互作用关系的蛋白质。系统进化分析显示BmRing与果蝇的Dm SCE、意大利蜜蜂的AmRing等的亲缘关系较近。以家蚕5龄第3天幼虫的卵巢c DNA为模板,克隆了BmRing基因,并利用半定量RT-PCR检测BmRing基因在5龄第3天幼虫的精巢、卵巢、头部和血细胞中有明显表达,而在其他组织中几乎不表达。获得的上述基础信息,有益于进一步研究BmRing的生物学功能。     

氮素诱导的甜菜gln2的克隆及序列分析

本文探索了在氮素诱导下,甜菜gln2序列变化情况及氮素对gln2的调控表达情况。根据已知甜菜谷氨酰胺合成酶基因(gln2,登录号为AY026353)设计特异引物,利用RT-PCR方法克隆甜菜质体型谷氨酰胺合成酶的cDNA(GS2 cDNA)片段和甜菜质体型谷氨酰胺合成酶基因组DNA(GS2 DNA)序列,并进行生物信息学分析。获得甜菜GS2 cDNA片段序列,并首次得到甜菜GS2 DNA序列,并将GS2DNA登录到了NCBI网站的GenBank(登录号为EU558132)。生物信息学分析结果表明,GS2 DNA长度为6 144bp,含有13个外显子和12个内含子;氮素诱导的GS2 cDNA序列长度为1 296bp,与gln2序列相似性达99.92%,可编码431个氨基酸残基;其氨基酸序列与其它植物的质体型谷氨酰胺合成酶(GS2)有很高的同源性,与菠菜GS2的同源性最高,属于混合型蛋白,具有Gln-synt保守功能域,N端为beta-Grasp domain,C端为catalytic domain。采用半定量PCR分析该基因在氮素处理下的诱导表达情况,结果表明,NO3-N∶NH4+-N=80∶20和NO3-N∶NH4+-N=50∶50的处理对GS2基因表达的促进效果最好,NO3-N∶NH4+-N=0∶100对GS基因诱导作用最差。研究甜菜GS基因的结构功能及表达调控对甜菜实现高同化氨及增产增糖有重要意义。     

草果AtNCED基因克隆、表达和植物表达载体构建

9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, NCED)是ABA生物合成的限速酶。诸多研究表明NCED基因表达量的变化与ABA含量显著相关,在种子休眠过程中发挥重要作用。为探究草果AtNCED基因的序列特征和功能,本研究以草果(Amomum tsaoko Crevost et Lemarie)种子转录组为基础,采用RT-PCR技术克隆了一个AtNCED基因。该基因全长2 372 bp,包含一个1 830 bp的开放阅读框(open reading frame, ORF),编码610个氨基酸。生物信息学分析显示,AtNCED基因编码的蛋白在N-末端包含典型的叶绿体转运肽序列,在催化结构域含有4个高度保守的组氨酸残基。AtNCED蛋白与芭蕉科马来西亚蕉同源性较高,与其他单子叶植物处在同一进化分支。实时荧光定量PCR分析结果表明,AtNCED基因表达量随着层积时间的增加逐渐下降,该基因可能正向调控种子休眠,在草果种子休眠诱导与维持中发挥重要作用。进一步地,利用同源重组方法,成功构建了pBI121-AtNCED过表达载体,并转化至农杆菌EHA105。该研究结果为弄清ABA激素信号在种子休眠中的调控作用提供了帮助。     

pIRES2-EGFP-prnd真核表达载体的构建及其在BHK细胞中的表达

为探讨叠朊蛋白(Doppel)在正常生理条件及相关疾病中的临床及生物学意义,构建BALB/c小鼠Doppel基因prnd的重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-prnd,并转染BHK细胞,IFA检测其表达情况。结果表明,Doppel蛋白通过pIRES2-EGFP-prnd在BHK细胞中表达。试验可为进一步研究Doppel蛋白的结构、正常的生理生化功能及其与相关疾病的关系提供重要工具。     

销售新手:经常拿镜子照照自己的后脑勺

正笔者结合自己多年的销售实践,总结出一个销售工作人员,尤其是销售新手经常会犯的十大错误,在此希望能给读者以启迪。一、表现的不够自信,或是对自己估计过高。不自信是新手的通病,感觉拜访客户心里没底,不知道该如何表达,不知道如何交流,如何推荐自     

Cloning and Sequence Analysis of Buffalo Keap1 Gene and Investigation of Its Expression Pattern in Different Tissues

In this study,the CDS sequence of buffalo Keap1 gene was cloned and analyzed,then its expression pattern in different tissues was also investigated.A pair of primers of buffalo Keap1 gene was designed based on the nucleotide sequence of Bos taurus Keap1 gene from GenBank,and then the buffalo Keap1 gene was amplified.Using the bioinformation techniques,the gene sequence and the protein structure were analyzed.The expression level of Keap1 gene in different tissues were detected with Real-time quantitative PCR.The results showed that the length of buffalo Keap1 gene coding sequence was 1 875 bp and encoded 624 amino acids.The multiple sequence alignment results showed that buffalo Keap1 gene shared 99%,96%,92% and 90% of similar nucleotide sequence with that of Bos taurus,Ovis aries,Sus scrofa and Homo sapiens,respectively.And the phyogenetic tree also showed the conservatism between several different species.The second structure of buffalo Keap1 protein was predicted as 24 alpha regions,40 beta regions,38 turn regions and 27 coil regions.In addition,the results of Real-time quantitative PCR showed that Keap1 mRNA exists in all seven tissues,but the most abundant expression was in heart and the minimal expression was in liver and spleen.The results provided an foundation for further study of Keap1-Nrf2-ARE signal pathway,for enhancing the ability of antioxidant of buffalo embryo in vitro culture.     

香蕉MYB基因克隆和表达分析

【目的】获得香蕉抗逆相关转录因子。【方法】通过随机克隆测序的方法从香蕉根系c DNA文库中获得MYB基因,命名为Ma MYB1。【结果】对扩增获得的c DNA序列进行生物信息学分析,表明Ma MYB1是香蕉MYB基因编码框全长c DNA,包含一个951 bp的最大开放阅读框,编码一个长316个氨基酸的蛋白质。蛋白质序列同源比对发现其含有完整的2个保守的MYB结构域R2和R3,属于典型的R2R3-MYB基因。系统进化树比对分析表明,Ma MYB1与海枣(XP_008808341.1)和油棕(XP_010914123.1)的亲缘关系较近。组织特异性研究表明该基因在叶、根和花中的表达量较高。实时荧光定量PCR分析表明Ma MYB1响应干旱、低温、盐和枯萎病菌的侵染等胁迫处理。【结论】Ma MYB1基因在香蕉响应逆境中扮演重要的调控角色。     

高铜日粮对肉鸡肝脏Trx2蛋白表达的影响

将200羽1日龄Cobb商品代肉鸡随机分为4组,各组日粮中铜含量分别为:对照组(Ⅰ组)11 mg/kg、试验Ⅱ组110 mg/kg、试验Ⅲ组330 mg/kg、试验Ⅳ组550 mg/kg。饲养至10、30、50 d时每组各取5只鸡用于采集肝脏样品,提取肝脏总RNA用RT-PCR法测定Trx2基因m RNA在肝脏中的表达量,用蛋白质印迹法检测Trx2蛋白表达量。结果显示:日粮铜含量为11 mg/kg、110 mg/kg和330 mg/kg时,随着试验时间的延长,肝脏Trx2基因表达升高,但差异不显著(P0.05),而铜含量为550 mg/kg时,Trx2基因表达量降低且50 d时差异显著(P0.05);随着试验时间的延长,各试验组的Trx2蛋白表达量均升高,且330 mg/kg和550 mg/kg组在50 d时差异显著(P0.05)。试验表明,饲喂高铜日粮可导致线粒体型硫氧还蛋白2(Trx2)mRNA在肝脏中的表达量先升高后降低,蛋白表达量升高。     

传染性法氏囊病病毒主要结构蛋白VP2、VP1和VP2-VP1串联基因的原核表达及其初步应用

为获得传染性法氏囊病病毒(IBDV)特异性抗体检测用抗原VP2、VP1及VP2-VP1蛋白,分别设计引物扩增IBDV野毒株NN1172的VP2和VP1基因,并扩增VP2和VP1基因中抗原性和亲水性较好的重要区域,通过PCR扩增基因串联方法对截短的VP2和截短的VP1基因进行串联,首次获得VP2-VP1串联基因,并对VP2、VP1和VP2-VP1串联基因进行了原核表达和鉴定。结果成功构建了原核表达载体pET-VP2、pET-VP1和pET-VP2-VP1;诱导表达条件显示,3个重组质粒分别转入BL21菌株后经0.05 mmol/L IPTG诱导表达,分别得到分子量为69、114和63 kDa的VP2、VP1和VP2-VP1重组蛋白,且均以包涵体形式表达,3个重组蛋白分别于诱导后5、3和6 h时表达量最多。Western blot结果显示,表达的VP2、VP1和VP2-VP1蛋白与鸡抗IBDV阳性血清均具有良好的反应原性。以纯化的VP2、VP1和VP2-VP1蛋白作为包被抗原对传染性支气管炎病毒(IBV)、呼肠孤病毒(ReoV)、禽白血病病毒(ALV)和新城疫病毒(NDV)4种阳性血清检测均为阴性,表明所获得的纯化蛋白具有高度的特异性;对免疫了IBD灭活疫苗,IBD基因工程疫苗和IBD弱毒疫苗的商业鸡群进行抗体检测,结果均能显示疫苗免疫后机体抗体水平的变化趋势。本研究表明利用该原核表达系统所表达的3个蛋白均具有良好的免疫反应活性,为IBDV特异性抗体的检测和新型亚单位疫苗的研发奠定基础。