国内猪源睾丸酮丛毛单胞菌的分离与鉴定

为查明2018年8月云南省曲靖市富源县某规模化猪场发生母猪产死胎、弱仔猪的病因，本试验采集弱仔猪内脏组织病料进行病原菌的分离培养、生化鉴定、16S rRNA扩增、药敏试验及致病性试验。结果显示，从弱仔猪大脑组织内分离培养出1株菌落形态呈圆形、半透明的革兰氏阴性短杆菌。生化鉴定结果显示，衣康酸盐同化（ITA）、辛二酸盐同化（SUB）、乙酸盐（ACE）、DL-乳酸盐同化（LAT）、丙酸盐同化（PROP）、3-羟基-丁酸盐（3OB）、脯氨酸（PRO）生化反应结果呈阳性；丙氨酸同化（ALA）、D-甘露醇（MAN）、D-葡萄糖（GLU）、癸酸盐（CAP）、丝氨酸同化（SER）等生化反应结果呈阴性，其16S rRNA序列与GenBank中丛毛单胞菌属（Comamonas sp.）EB172株（登录号：EU847238.1）的16S rRNA核苷酸序列同源性达99%。药敏试验结果显示，其对阿莫西林/克拉维酸、头孢噻吩、多黏菌素E、复方新诺明、大观霉素、呋喃妥因和多西环素敏感。致病性试验结果显示，以0.3 mL 9.3×10⁸ CFU/mL的细菌悬液腹腔接种小鼠，72 h内共有7只死亡（7/12）。本试验结果表明，弱仔猪及流产胎儿存在睾丸酮丛毛单胞菌感染。     

斑点叉尾鮰源致病性维氏气单胞菌的分离与生物学特性鉴定

为鉴定一起致斑点叉尾鮰突然发病死亡的病原，本研究从发病斑点叉尾鮰中分离到1株致病菌GZTL2017，通过临床解剖观察、细菌分离培养、革兰氏染色镜检、动物回归试验、生化试验、16S rDNA序列分析、部分毒力基因检测和药敏试验进行鉴定。临床解剖观察结果显示，患病斑点叉尾鮰呈现体表溃疡、鳍根部出血、烂腮、肠管充血等症状；分离菌在培养基中呈现表面湿润凸起、边缘光滑半透明、形态均一的乳白色菌落；革兰氏染色镜检显示，分离菌为单个或成双存在、两端钝圆的短直阴性杆菌；动物回归试验显示，该分离菌有较强的致病性；生化试验结果显示，分离菌具有运动性，且氧化酶、V-P、赖氨酸脱氢酶等反应阳性，精氨酸双水解酶、硫化氢等反应阴性；16S rDNA基因序列系统进化树显示，该菌与维氏气单胞菌聚为一支，同源性均>99%；毒力基因检测结果显示，该菌能检出气溶素基因（Aer）、黏附素基因（Aha）、外膜蛋白基因（OmpA）3种毒力基因；药敏试验结果显示，该菌对氟苯尼考、强力霉素、氧氟沙星等14种药物敏感；对诺氟沙星、新霉素、万古霉素等7种药物中度敏感；对麦迪霉素、苯唑西林、头孢拉定等8种药物耐药，且对氟苯尼考、强力霉素的药物最小抑菌浓度分别为1和2 μg/mL。本试验成功分离到1株维氏气单胞菌，为斑点叉尾鮰维氏气单胞菌病防治提供参考依据。     

人工感染维氏气单胞菌对杂交鲟体内组织抗菌肽含量的影响

为探究抗菌肽在鲟鱼体内的表达规律,试验采用维氏气单胞菌人工感染杂交鲟后,采集不同时间段杂交鲟的肝脏、脾脏、心脏、肌肉、肠道、鳃6个组织样品,利用ELISA方法进行抗菌肽含量的检测。结果:(1)正常对照组杂交鲟6个组织中均有抗菌肽表达,在鳃和肠道组织中含量最高,在肝脏中含量最低。(2)与正常对照组比较,人工感染组杂交鲟6个组织中抗菌肽含量在不同时间段均明显升高,差异显著(P<0.05)。其中:在24 h和96 h鳃和肠道的抗菌肽含量差异极显著(P<0.01);在48 h肝脏、肌肉、心脏、脾脏的抗菌肽含量差异极显著(P<0.01)。结论:杂交鲟可能是通过抗菌肽来抵御细菌感染,这为杂交鲟细菌性疾病的防治提供了新思路。     

5种中药提取物及其组合对嗜水气单胞菌的体外抑制作用

试验旨在探讨大黄、诃子、五倍子、黄连、黄芩5种中药及其组合对嗜水气单胞菌的体外抑制作用。试验测定了5种中药的水提物和醇提物对3株嗜水气单胞菌的抑菌圈、最低抑菌浓度（MIC）、最低杀菌浓度（MBC）及对嗜水气单胞菌生长的影响，采用棋盘交叉法测定了5种中药联合抑菌作用。结果显示，大黄和黄芩醇提物的抑菌圈显著高于其水提物（P<0.05），诃子和黄连水提物的抑菌圈显著高于其醇提物（P<0.05），五倍子水提物和醇提物抑菌圈大小相近。五倍子抗菌作用最强，其水提物和醇提物MIC为7.81～15.63 g/L，大黄醇提物和诃子水提物抗菌作用次之，MIC均为15.63～31.25 g/L。选择抑菌作用更强的提取物两两组合，五倍子水提物与其他4种中药提取物组合、大黄醇提物与黄连水提物组合均为协同作用；黄连水提物与黄芩醇提物组合为相加作用；大黄醇提物与黄芩醇提物、诃子水提物与黄连水提物组合均为无关作用；诃子水提物与黄芩醇提物组合为拮抗作用。研究表明，5种中药对嗜水气单胞菌均具有抑制作用，五倍子作用最强，五倍子水提物与其他4种中药提取物两两组合、黄连水提物与黄芩醇提物组合均可增强抗菌活性。     

细鳞鲑疖疮病的病原鉴定及防治药剂筛选

自然发病的细鳞鲑(Brachymystax Lenok)出现鳃盖边缘、鳍条基部充血,鳍条溃烂,肛门红肿等症状。从病灶处分离得到的优势菌株,定名为BJSY-1、BJSY-2、BJSY-3。通过回归感染试验证明BJSY-1为致病菌,其LD_(50)为6.97×10~5CFU/mL。经生理生化鉴定和16S rDNA序列分析最终确定BJSY-1菌株为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.Salmonicida)。该菌对四环素类、喹诺酮类等药物高度敏感。选择氟苯尼考作为治疗药物,按20 mg/kg·bw的用药量拌饵投喂,每天投喂1次,连续投喂有较好的治疗效果,为杀鲑气单胞菌的治疗和防控提供了参考。     

一株岩原鲤源致病性ST-251型嗜水气单胞菌的分离与生物学特性研究

为探究宜宾某岩原鲤(Procypris rabaudi)养殖场以体表出血为特征的流行性疾病的病因,通过生理生化特性检测与16S rDNA、致病性试验、多位点序列分型(MLST)、纸片扩散法(K-B)明确该流行病的病原及其生物学特性。结果显示,从病鱼的肝、肾分离获得一株病原菌(YYL),鉴定其为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila),在水温(24±1)℃时,该菌对体重为(12.6±0.8)g的岩原鲤半数致死量(LD₅₀)为5.8×10⁴ CFU·g^-1;药物敏感性试验表明,该菌对头孢他定、庆大霉素、多西环素、恩诺沙星、氟苯尼考等敏感,对亚胺培南、罗红霉素、复方新诺明、磺胺异恶唑、克林霉素耐药;MLST分子分型其属于ST-251型,并携带aerA、hlyA、aphA、act、ast等毒力基因。该研究从体表出血为特征的发病岩原鲤分离到ST-251型嗜水气单胞菌,该菌株携带多种毒力因子,致病力强,在岩原鲤的养殖中应加强对该病原感染的预防与控制。     

杀鲑气单胞菌灭活疫苗的制备及其在大菱鲆体内的免疫效果

为了预防大菱鲆疥疮病,本研究将杀鲑气单胞菌菌株HHSM1905经甲醛灭活制备成灭活疫苗,通过腹腔注射途径免疫健康大菱鲆;对免疫后大菱鲆血清抗体效价、血清溶菌酶(LZM)活性、酸性磷酸酶(ACP)活性及疫苗保护率进行测定;以β-actin为内参,对免疫相关基因(IL-1β、TLR-5、MHCⅠ、MHCⅡ-α、CD4)表达情况进行定量PCR分析。结果显示,在免疫后2周时,疫苗组血清抗体效价显著高于对照组并达到最大值;疫苗组LZM活性在免疫2周时达到峰值,4周时仍与对照组保持显著差异;疫苗组ACP活性在免疫后的2周达到峰值,与对照组差异显著;灭活疫苗相对保护率(RPS)为72.72%。免疫组与对照组相比,IL-1β、TLR-5、MHCⅠ、MHCⅡ-α、CD4的表达量均呈上调趋势,与对照组差异显著。本研究成功制备了大菱鲆用杀鲑气单胞菌灭活疫苗,其对大菱鲆疥疮病能够起到一定的预防作用,可为大菱鲆养殖过程中疾病预防提供新方法。     

嗜水气单胞菌黏附素基因克隆、序列分析及表达

利用PCR方法对江浙一带淡水鱼类暴发病病原致病性嗜水气单胞菌主要血清型O:9和O:97代表菌株TPS-30和BSK-10的黏附素基因(Al)进行扩增,并分析不同血清型和不同来源菌株Al的序列差异.结果表明:嗜水气单胞菌TPS-30株与BSK-10株相比较,Al序列在N端有个突变区,TPS-30株的Al基因突变区较BSK-10株短;通过pET28a(+)载体构建TPS-30株黏附素基因的表达载体pET28a-AHal,转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,通过SDS-PAGE分析,显示与预期大小约41ku相吻合的融合蛋白带,诱导6h后目的蛋白获得了高效表达,表达量占菌体总蛋白的44.0%;通过免疫攻毒试验发现,免疫银鲫后血清效价在第5周达到峰值,重组表达的蛋白对同源菌株TPS-30和异源菌株BSK-10都具有较高的免疫保护率,分别达到94.7%和77.8%.这为基因工程亚单位疫苗的开发奠定了基础.     

3种检疫性黄单胞菌的基因芯片检测

本研究建立了基因芯片检测我国检疫性细菌水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和柑桔溃疡病菌。以RNA多聚酶西格玛因子(RNA polymerase sigma factor,rpoD)基因为靶标,设计了一对通用引物和3条特异性探针能够同时检测这3种重要的病原菌。检测结果表明:建立的基因芯片检测方法特异性强,能实现上述3种黄单胞菌的准确检测,为植物致病菌的检测提供了理想手段,有良好的应用前景。     

编码harpin_（Xoo）蛋白的基因hpa1_（Xoo）转化菊花增强对蚜虫的抗性

将水稻白叶枯病原菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae编码harpinXoo蛋白的hpa1Xoo基因构建植物重组表达质粒pCAMBIA3300-hpa1Xoo-bar,由根癌农杆菌Agrobacterium tumefa-ciensLBA4404介导,叶盘法转化寒菊QX-077,获得了草丁膦转基因寒菊株系。经PCR、Southernblot和RT-PCR检测证明hpa1Xoo已整合到寒菊基因组中。在转基因株系的叶片和植株上抗虫性鉴定表明,转基因寒菊显著抑制桃蚜Myzus persicae的繁殖（t〈0.01）。RT-PCR表明转基因植株中hpa1Xoo能够在转录水平正常表达。hpa1Xoo转化寒菊可以正常表达并提高寒菊对蚜虫的抗性。