检测与诊断猪圆环病毒PCR技术的建立及病毒的分离鉴定

本研究建立了检测与诊断猪圆环病毒的PCR方法,并对该方法进行了标准化研究。该方法快速、敏感、特异性强,可扩增10ng的阳性质粒的DNA,可以从30μL病料组织悬液或全血中扩增检测出PCV,并且该方法可以区分PCV1和PCV-2,对其它病原微生物如PPV、PRRSV、SIV以及许多细菌不能检出。应用此方法对6省市的12个猪场的225份病料进行了检测,对阳性病料进行了病毒分离,对分离的病毒进行了电镜观察与序列测定,结果证实分离的病毒为PCV-2。     

南美白对虾（Litopenaeus vannamei）幼虾和杜拉对虾（Farfantepenaeus duorarum）稚虾对六种白斑综合病病毒（WSSV）地理隔离株的免疫比较

白斑综合病病毒(WSSV)是一种对对虾养殖危害性最大的病原体之一。它广泛分布在大多数养殖对虾的亚洲国家以及墨西哥湾、美国。我们采用南美白对虾(Litopenaeus vannamei)幼虾和杜拉对虾(Farfantepenuaeus duorarum)稚虾对六种WSSV地理隔离株的病毒性进行免疫比较。这6组WSSV地理隔离株分别取自中国、印度、泰国、美国德克萨斯州、南卡来罗纳州的对虾以及美国国家动物园养殖的淡水龙螯虾。为了进行免疫性试验研究，我们把病毒感染组织接种到南美白对虾幼虾和杜拉对虾稚虾中。通过组织检查结果证实发生WSSV感染。在这次免疫性试验中，被六组WSSV地理隔离株感染的南美白对虾幼虾的死亡率为100％。其中，德克萨斯州的病毒比其它的病毒厉害，最快引起实验对象死亡，而淡水龙虾的WSSV病毒致病性最慢。与之形成显著对比，杜拉对虾稚虾的死亡率仅为35％--60％，并且对不同的病毒其死亡率也有所不同。值得注意的是，杜拉对虾对德克萨斯州病毒感染也是最为严重，而对淡水龙虾病毒的感染最轻。这个实验结果表明：不同地区的WSSV病毒对实验对象的致病性略有不同，不同品种的对虾及同一种对虾在其生长的不同阶段对病毒的易感性也有所不同。     

草鱼细胞和病毒的大规模培养研究

本文对草鱼细胞和病毒的两种大规模培养方式进行了研究和比较。静置培养条件下，细胞生长速度快，２—３天内可形成单层，单层均匀而稳定；旋转培养条件下，细胞７天左右长成单层，细胞单层面积大，病毒培养产量高。这两种培养方式所观察到的细胞病变过程及表征基本相同，病毒的ＴＣＩＤ５０／ｍｌ值稳定在６．０左右。采用这两种培养方式，可实现草鱼细胞和病毒的大规模培养。     

白斑综合症病毒在日本囊对虾精养池塘中的动态变化

用实时荧光定量PCR技术检测了高密度精养池塘中日本囊对虾体内及浮游动物白斑综合症病毒携带量的动态变化,检测结果显示,两口池塘的日本囊对虾苗种均携带白斑综合症病毒,达2.43×10~5~9.42×10~5 IU/mg;浮游动物也携带微量白斑综合症病毒,达6.78×10~2~8.02×10~2 IU/mg。在整个养殖过程中,日本囊对虾多个组织均携带白斑综合症病毒,平均病毒量为鳃肌肉肝胰腺胃;各组织病毒携带量的变化趋势不一致,肌肉、肝胰腺、胃等呈现明显的先降后升趋势,最低降至1.78×10~3 IU/mg,鳃白斑综合症病毒携带量的下降幅度较小,最低为7.29×10~4 IU/mg。浮游动物的病毒量在白斑综合症爆发前波动不明显,发病时急剧升高。综合认为,苗种携带是白斑综合症病毒的主要来源;当养殖进入中后期,底质变差、水温降至病毒适宜复制的温度时,易爆发白斑综合症。     

白斑综合证病毒胶体金免疫层析试剂板的研制

将胶体金免疫层析技术应用于对虾白斑综合征的诊断,研制了一种检测对虾中白斑综合征病毒的胶体金免疫层析试剂板.将胶体金标记的抗白斑综合征病毒单克隆抗体包被在金标垫上,将抗白斑综合征病毒多克隆抗体和羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上.通过双抗体夹心法检测样品中自斑综合征病毒含量.结果表明,该试剂板对白斑综合征病毒的最低检出限为1.0 mg/kg,特异性好,稳定性高,整个检测所需时间为8～10 min,适合现场快速检测.     

鳜鱼养殖中的常见疾病及其防治

就目前国内鳜鱼养殖过程中的常见疾病及其防治进行了综述.研究认为鳜鱼疾病应以预防为主,优质的水源条件、良好的种质和饵料鱼来源、科学的管理是现代化鳜鱼规模养殖的关键.主要从"水、种、管、饵"4个方面详细介绍了鳜鱼养殖过程中疾病发生的原因,按真菌性疾病、细菌性疾病、寄生虫病和病毒性疾病分类介绍了养殖过程中的常见疾病,最后针对疾病发生的原因提出科学的预防和治疗措施.     

中国对虾不同凝集素基因应答WSSV侵染的表达差异

本研究探讨了7种细胞凝集素基因在中国对虾中应答白斑综合征病毒(WSSV)感染上的生物学功能差异.结果显示,LT1 (DQ167572.1)、LT2(EU834289.1)、LT3 (EU834292.1)和LT5(EU834290.1)是肝胰腺组织特异、受WSSV感染诱导表达的基因,其他3种基因主要在肌肉、肠和腮中表达,与WSSV感染诱导无明显相关;在应答WSSV感染不同时间段的表达特征上,7种凝集素基因各不相同;在各组织中的表达量上,方差分析表明7种凝集素基因除在肝胰腺中的表达上存在显著差异外,其他组织中不存在显著差异.这些结果显示这7个凝集素基因在应答WSSV侵染的表达特征上存在较大差异,推测其在中国对虾体内免疫防御功能上的作用也各不相同.     

大鲵蛙病毒感染大鲵的动态病理损伤及病原的组织分布

本研究旨在观察大鲵在大鲵蛙病毒(Chinese giant salamander ranavirus,CGSRV)感染过程中组织的动态病理损伤,同时定量检测CGSRV在组织中的动态分布。对大鲵腹腔注射1.0×106.5 TCID50/m L的CGSRV进行人工感染,在感染的0d,3d,5d,7d,9d,13d,16d随机采集3尾,取肝、肾、脾、肺、肠、皮肤、肌肉、脑、心脏和胃等组织,石蜡切片和HE染色对CGSRV感染大鲵的病理损伤过程进行观察,采用SYBR Green q PCR技术对病毒在组织中的动态分布进行定量研究。组织病理结果表明,CGSRV感染导致大鲵多组织器官损伤,其中肝、脾、肾和皮肤肌肉病变严重,为损伤靶器官,且在一些损伤的细胞内见嗜碱性或嗜酸性包涵体。感染后3d肝细胞与肾小管上皮细胞变性,肾间以及肝小叶中央静脉周围淋巴细胞和嗜酸性粒细胞浸润;感染后5~7d实质性器官变性、坏死,炎症加重,胃肠道呈卡他性炎。感染后9d表皮细胞坏死、脱落,肌纤维变性、坏死。感染后13~16d肝出现广泛变性、坏死与炎症,脾淋巴细胞数量显著减少,肾小球渗出性-坏死性炎,皮肤肌肉呈出血性坏死性炎和实质性心肌炎。SYBR Green qPCR结果显示,整个感染进程中各组织CGSRV含量呈上升趋势,不同组织中病毒量为2.36×103~1.84×109 copy/mg组织,其中肺、肠、肝、脾、肾和皮肤肌肉含量高,表明CGSRV具有广泛的组织分布特征,但肝、脾、肾、皮肤肌肉为其复制和损伤的靶器官,且病毒分布量与病理损伤程度呈正相关。     

养殖克氏原螯虾体内白斑综合征病毒的绝对定量分析

近年来克氏原螯虾的养殖受到WSSV的威胁,病毒在宿主组织中的绝对定量对于了解病毒的致病性具有重要意义,但克氏原螯虾组织中WSSV的绝对定量分布还有待研究。实验调查了湖北省5个主养区克氏原螯虾WSSV的感染率,结果表明80%以上克氏原螯虾都携带有WSSV。采用WSSV-VP28蛋白特异性抗体对克氏原螯虾提取蛋白进行Western Blot检测,在WSSV-PCR阳性样品中可检测到VP28特异性条带,在WSSV-PCR阴性样品中没有检测到相应条带。采用实验室建立的WSSV绝对定量PCR方法,对携带病毒的克氏原螯虾6个组织(鳃、胃、肠、血淋巴细胞、肝胰腺和心脏)进行检测。结果表明,在鳃、胃和肠可检测到较多病毒量(约108拷贝/mg),其次是血淋巴细胞(107拷贝/mg)、肝胰腺(106拷贝/mg),在心脏中病毒的含量最低(103拷贝/mg),表明病毒的复制存在组织特异性。结果显示WSSV主要存在于消化系统中,预示着克氏原螯虾可能主要在摄食过程中感染WSSV;不同地区克氏原螯虾组织病毒携带量表现出一定差异,预示着WSSV感染可能受到环境因素的影响。     

三角帆蚌肝脏瘟病感染期抑制性消减cDNA文库的构建与分析

采用抑制性消减杂交技术构建了三角帆蚌肝脏瘟病感染期抑制性消减cDNA文库。经检验,差异表达基因均被富集了 2¹⁰倍左右,证明构建的 cDNA 消减文库具有很强的消减效率。PCR 鉴定发现,在随机挑取的阳性克隆中,95% 的克隆均含有 0.2～1.0 kb 的插入片段,这些片段可能是三角帆蚌瘟病病毒感染后差异表达基因的cDNA片段。测序共获得 214 个有效 cDNA 序列,分别属于8 大类,共 98 个基因。其中细胞分裂基因 2个、细胞结构与运动基因 9 个、代谢基因 10 个、信号传导基因 7 个、细胞防疫基因 10 个、基因与蛋白表达基因 20 个、未知功能蛋白基因 26 个,GenBank中找不到任何同源序列的基因 14 个。结果说明,构建的差异表达cDNA文库,可较好地反映三角帆蚌瘟病病毒对三角帆蚌影响的基因信息。