猪星状病毒ORF2基因的克隆及序列分析

参考GenBank上发表的猪星状病毒亚基因组序列,设计1对引物,对猪星状病毒广西流行株衣壳蛋白ORF2基因进行扩增,最终克隆得到PAstV/NNJG7株的衣壳蛋白完整序列.序列分析发现,其ORF2全长2 358 bp,编码786个氨基酸;与猪星状病毒Ⅰ型参考株核苷酸同源性最高,为77.3％～79.4％;在ORF1b和ORF2连接处有一段高度保守的序列,在ORF2 3'端有一段长83 bp非翻译序列及一个含43 bp高度保守的茎环样基序.本试验不仅丰富了猪星状病毒衣壳蛋白基因序列,也为基因疫苗和诊断试剂盒的研制提供材料及理论依据.     

猪圆环病毒3型SYBR greenⅠ荧光定量PCR方法建立及初步应用

为建立一种快速、特异、敏感的SYBR greenⅠ实时定量PCR方法,检测猪圆环病毒3型(PCV3)在感染猪体内的分布情况和病毒含量,本研究根据PCV3的cap基因序列设计1对引物,对反应条件、反应体系进行优化,建立了检测PCV3 cap基因的SYBR greenⅠ实时定量PCR方法,并对动物回归试验后剖检的病料组织进行了检测。结果,该方法比传统PCR方法灵敏度高100倍,可达3.04×10~2拷贝/μL,且具有良好的特异性和重复性。在不同病料组织中均可检测到PCV3,但不同感染猪、不同组织病毒检出及含量有差异,其中肝脏、肺脏、颌下淋巴结中病毒含量显著高于心脏、心包肌、肾脏等;肝中病毒拷贝数最高,达1.16×10~6拷贝/μL,表明PCV3具有一定的组织嗜性。该方法可用于PCV3的病原学监测、流行病学调查及定量研究。     

闽西地区猪源大肠杆菌O157：H7的分离与鉴定

大肠杆菌(E.coli O157)是一种新型的致病性大肠杆菌，能引起人类出血性腹泻和溶血性尿毒综合征，该菌无侵袭力，也不产生肠毒素，但能产生一种毒力甚强的细胞毒素，引起盲肠、阑尾和升结肠黏膜上皮细胞坏死、黏膜充血、水肿和出血，还可进入血液。并通过血脑屏障，损伤血管内皮细胞而引起血栓     

家蚕丝蛋白基因在不同发育时期表达量的变化

本文采用半定量RT-PCR方法,检测了家蚕4～5龄期丝腺中5个丝蛋白基因(Fib-H、Fib-L、Ser-2短片段、Ser-2长片段、Ser-3)在不同发育时期表达量的变化。结果表明,Fib-H、FIB-L及Ser-3基因的表达规律相似,总体上4龄期表达量明显低于5龄,但4龄眠期均有明显表达,从5龄起蚕以后表达量逐渐上升,至熟蚕或熟蚕后2d达到高峰,此后迅速下降;Ser-2基因两个转录本的表达规律基本一致,与以上3个基因相比,Ser-2基因在4龄期存在相对较高的表达量,但在4龄眠期表达量明显降低,从5龄起蚕以后表达量逐渐上升,Ser-2短片段和长片段分别从5龄96h和144h之后表达量开始降低,到熟蚕期基本达到最低值。     

鸡源大肠杆菌ESBLs基因型检测及其耐药性分析

采用K-B法检测30株鸡源大肠杆菌对16种抗菌药物的耐药性,根据耐药表型和超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的基因型流行情况,指导临床合理用药.结果表明,24株大肠杆菌为产ESBLs株.扩增出了与预期片段大小相符的TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型基因.有5株同时检测出TEM和CTX-M基因.产酶大肠杆菌对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、环丙沙星的耐药率100%.其多重耐药性明显比非产酶大肠杆菌严重.     

猪瘟病毒石门株NS3蛋白的原核表达及其抗体检测间接ELISA的建立

为配合猪瘟新型疫苗的研发,建立了猪瘟病毒NS3蛋白抗体检测间接ELISA,以期达到有效区分新型疫苗免疫猪与自然感染猪(包括常规疫苗接种猪)的目的。以接种猪瘟病毒(CSFV)石门株的PK-15细胞为模板提取总RNA,经特异性PCR扩增获得长度为2 049bp的CSFV NS3基因,将其克隆至插入了具有自聚集自切割功能短肽的原核表达载体pET-32a(+),在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中优化表达CSFV石门株NS3基因。Western blot分析表明重组蛋白NS3具有反应原性。将纯化的重组蛋白NS3作为包被抗原建立检测CSFV NS3抗体的间接ELISA,以美国爱德士(Idexx)猪瘟病毒抗体检测试剂盒抗体检测结果为标准,对502份血清样品进行检测。结果表明,所建立方法的特异性为96.9%,敏感性为89.7%,总符合率为95.8%,为猪瘟新型疫苗的推广应用提供了血清学检测方法。     

鹅源禽副粘病毒NA-1株HN蛋白基因的遗传变异研究

鹅副粘病毒分离株NA-1株经11日龄鸡胚增殖后纯化。提取病毒的基因组RNA，采用RT-PCR扩增出与预期设计的1．7kb大小相符合的特异条带。将扩增产物提纯后克隆入pMD18-T载体，经纯化、筛选及酶切鉴定后，初步获得了含鹅副粘病毒HN基因的阳性克隆，并对阳性克隆进行了测序。测序后拼接得出HN基因的全序列长度为1740bp，该基因的ORF总长为1716bp，编码571个氨基酸。与GenBank下载的15株参考毒株比较HN基因编码区全核苷酸序列，发现所测NA-1株与国内标准强毒株F48E9核苷酸的同源性为84．5％，氨基酸的同源性为89．5％；与传统的疫苗株La Sota核苷酸的同源性为82．2％，氨基酸的同源性为88．5％；与鹅源禽副粘病毒SF02株核苷酸的同源性为97．1％，氨基酸的同源性为97．4％；与鹅源禽副粘病毒YG97株核苷酸的同源性为97．3％，氨基酸的同源性97．4％。说明NA-1株和SF02株、YG97株亲缘关系较近，它们三者可能有着共同的来源。根据基因树分析，NA-1株应属于基因VII型新城疫病毒。由此更进一步证实新城疫可以感染水禽，且对鹅具有高度的致死性。     

山羊源产单核细胞李斯特菌的分离与鉴定

从贵州省盘县某养羊场病例组织样本中分离出1株疑似产单核细胞李斯特菌(Lm)。通过革兰染色、生化鉴定、PCR扩增hly基因、克隆、测序、序列分析及药敏试验等方法对可疑菌株进行分析鉴定。结果显示,该分离菌的培养特性、菌落形态、菌体形状特征、生理生化特征均与文献报道的产单核细胞李斯特菌相同,并从该分离菌株基因组中扩增到大小约850bp的Lm的特异性DNA片段,其序列与GenBank中其他Lm地方株核苷酸同源性在39.1%~99.7%之间,其中与从发病动物分离到的加拿大、瑞士参考株同源性最高,均达到99.7%,与其他途径分离到的参考菌株同源性都很低,分子水平上进一步证实分离菌株为产单核细胞李斯特菌,且从不同途径分离的地方株hly基因差异大。研究结果为本病临床防控与治疗提供理论依据。     

H1N1亚型猪流感病毒血凝素基因的克隆与表达

应用RT-PCR方法扩增了1株H1N1亚型猪流感病毒的血凝素基因,并克隆到pMD 18-T Simple载体中,经PCR、酶切和测序验证克隆正确后,亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )中,构建了重组质粒pcDNA-HA。在脂质体作用下重组质粒pcDNA-HA转染Vero细胞。间接免疫荧光试验结果表明,血凝素基因在Vero细胞中成功进行了瞬时表达,这为猪流感病毒DNA疫苗的进一步研究奠定了基础。     

H5N1禽流感病毒NA基因重组腺病毒表达载体的构建

构建携带有H5N1亚型AIV NA基因的重组腺病毒表达载体,为进一步研究AIV中NA基因在病毒致病过程中的作用及相关诊断试剂的开发提供依据。采用PCR的方法从构建好的包含有H5N1AIV NA基因的pMD-19T-N1质粒中扩增出NA基因,定向插入pAdtrack-CMV腺病毒穿梭质粒中,含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-N1与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在基因工程菌BJ5183中进行同源重组,获得腺病毒质粒pAdeasy-N1,将pAdeasyd-N1经pacⅠ线性化后转染HEK293细胞株,包装出含有NA基因的腺病毒pAd-N1。结果表明,构建含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-N1和含有目的基因的腺病毒质粒pAdeasy-N1经PCR、双酶切及核苷酸测序测定无误。线性化后的pAdeasy-N1转染HEK293细胞,成功获得腺病毒pAd-N1载体,经绿色荧光蛋白和RT-PCR分析证实,目的基因在该细胞中成功表达。