细菌β-内酰胺酶和氨基糖苷磷酸转移酶耐药基因可视化LAMP检测方法的建立和初步应用

为了建立快速准确检测微生物携带氨苄青霉素和卡那霉素抗性基因的环介导等温扩增(LAMP)方法,根据抗性基因β-内酰胺酶(bla)和氨基糖苷磷酸转移酶(Aph)基因序列,利用Primer Explo-rerV4在线工具设计特异LAMP引物,成功建立了检测上述2个基因的可视化LAMP方法.该LAMP体系在65 ℃条件下反应1...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因RT-LAMP检测方法的建立

本研究根据GenBank中登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)M基因保守序列6个特异性部位设计了2对引物,建立了PRRSV的环介导逆转录等温检测方法.结果表明,该方法灵敏度比RT-PCR高100倍;全部反应可在1 h内完成并可得到其特有的阶梯状条带,而且猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒的扩增结果均为阴性;在反应体系中添加SYBR GREEN Ⅰ染料后,可通过肉眼观察有无荧光而直接判定结果.该方法灵敏度高、特异性好,可作为猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速诊断方法.     

清代桂林环碧园平面复原研究

环碧园是清代桂林著名私家园林,时人赞誉其“不减辋川之胜”“不减淮浙盐商诸家”,但其形迹今已不存。根据《桂游日记》《白鹤洞图》等资料,将景观名称及方位信息转变为平面信息,逐步推导环碧园的选址布局和景观结构,复原出环碧园的平面示意图,并在此基础上分析其空间布局及造园特色,发现环碧园的造园选址巧妙,纳天然洞穴于园中;依托桂林的真山真水造园;在园林布局和建筑营造上突出功能性。     

冬枣环剥技术要点

环剥(开甲)是提高冬枣坐果率的有效措施,但必须掌握好以下要点.①环剥时间.环剥的时间取决于树龄、树势、花的数量和质量等.树龄3年以上、树势健壮、花量大的树在盛花期环剥.环剥前要掌握天气情况,最好做到环剥后3天内无降雨,便于伤口愈合.     

1-MCP处理采后红阳猕猴桃果实生理效应的研究

【目的】为探究1-甲基环丙烯（1-MCP）处理结合冷藏（1～4℃）贮藏采后‘红阳’猕猴桃果实条件下保鲜的分子调控机制。【方法】以‘红阳’猕猴桃果实为材料,采用1-MCP配合冷藏进行红阳猕猴桃保鲜,研究贮藏过程中果实生理效应的变化。【结果】1-MCP处理结合冷藏保藏可以减缓猕猴桃果实软化速度,抑制TSS、可滴定酸、VC及花色苷的降解,减缓MDA的积累,维持了SOD的活力,降低果实中乙烯释放量。利用RNA-Seq技术进行转录组学比较分析,共筛选获得2 380个差异表达基因,其中上调表达基因有1 503个,下调表达基因877个。GO富集分析表明,差异表达基因显著富集在细胞组分、分子功能和生物过程中的肽生物合成与代谢、酰胺生物合成、蛋白质运输、防御反应等功能类别。KEGG富集分析显示,上调基因主要富集于植物激素信号转导通路、半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路以及苯丙氨酸代谢、谷胱甘肽代谢等抗氧化等相关通路,推测蛋氨酸代谢表达的增加是减少乙烯合成的主要原因之一。下调基因主要富集在丙酮酸代谢通路、叶绿素代谢、烟酸和烟酰胺代谢以及蛋白酶体代谢通路等影响呼吸作用强度的通路。【结论】1-MCP结合冷藏处理‘红阳’...     

双重PCR检测马铃薯晚疫病和环腐病方法的建立

通过克隆马铃薯环腐病菌和晚疫病菌转录间隔区(ITS)序列,并对测序结果进行同源性比较,选取差异位点分别设计了两对引物P.IN1/P.IN2和C.IN1/C.IN2,并检测了引物的特异性及方法的灵敏度。引物P.IN1/P.IN2可扩增出1条363bp马铃薯晚疫病菌的特异性条带,在DNA水平上其灵敏度达18fg/μL;引物C.IN1/C.IN2可扩增出1条218bp马铃薯环腐病菌的特异性条带,在细菌数上检测灵敏度为104 cfu/mL。混合这两对引物构建双重PCR反应体系,能从马铃薯环腐病菌和晚疫病菌的混合DNA及感染这两种菌的马铃薯植株中同时扩增到363bp和218bp的特异片段。实现了同时对马铃薯晚疫病菌和环腐病菌的快速可靠检测。     

应用环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生李斯特菌的研究

目的建立环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生李斯特菌。方法根据单核细胞增生李斯特菌(LM)hlyA基因序列中的保守区域,采用在线引物设计软件Primer Explorer4.0进行设计,获得一套特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物,对单核细胞增生李斯特菌hlyA基因进行LAMP扩增,并与常规PCR方法进行比较。结果建立的LAMP方法能成功扩增出梯形条带,LAMP检测单核细胞增生李斯特菌纯培养物和人工染菌的灵敏度为5.44×102cfu/mL,而对照PCR检测的灵敏度为5.44×104cfu/mL。对10株细菌进行LAMP扩增,仅单核细胞增生李斯特菌得到阳性结果。从DNA提取到报告结果,耗时仅1h。结论 LAMP检测单核细胞增生李斯特菌灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便,有望发展成为快速检测食品中单核细胞增生李斯特菌的有效手段。     

马疱疹病毒1型LAMP检测方法的建立

本试验旨在建立一种检测马疱疹病毒1型（EHV-1）的快速、灵敏、特异的环介导等温扩增技术（LAMP）,同时评价该方法的可靠性。根据马鼻肺炎糖蛋白B（gB）基因特异保守序列设计多对LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪监测反应进程,进行引物筛选和反应条件的优化,建立能特异性扩增EHV-1 DNA的LAMP检测方法,并加入SYBR GreenⅠ通过肉眼判断结果。该方法在65 ℃恒温下作用50 min,使EHV-1 DNA获得了高效率的特异性扩增,与其他马易感病毒如马疱疹病毒4型（EHV-4）等无交叉反应;且具有极高的灵敏性,可检测到10^-4稀释的目标病毒,比普通PCR的灵敏度高10倍;反应结束后加入SYBR GreenⅠ肉眼观察的结果与LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪监测结果一致。通过将4份临床样品的LAMP检测结果与已得到验证的PCR结果进行比对,结果显示符合率为100%。本研究建立的LAMP检测方法具有快速、特异、灵敏、简单易操作且设备要求低等特点,具有实地检测EHV-1的前景。     

北美栅锈菌和松杨栅锈菌可视化检测体系建立

目的 为实现北美栅锈菌和松杨栅锈菌快速有效的鉴别及鉴定。 方法 本研究根据两种锈菌的28SrDNA基因序列设计若干组LAMP引物。经筛选得到的引物以北美栅锈菌、松杨栅锈菌、图拉斯叉钩丝壳菌、芍药白粉菌、梨胶锈菌、羊肚菌、金针菇的基因组DNA为模板进行LAMP反应并完成特异性检测;首先建立初始LAMP反应体系,再进一步优化LAMP反应体系的组分和反应条件,加入羟基萘酚蓝实现可视化检测;最后确定检测体系灵敏度。 结果 表明,筛选出的引物具有特异性;25 μL北美栅锈菌LAMP检测体系最佳Mg2＋浓度为6 mmol·L−1,最佳内外引物比例为8：1,最佳dNTPs浓度为1.2 mmol·L−1;同样地,25 μL松杨栅锈菌LAMP检测体系最佳Mg2＋浓度为4 mmol·L−1,最佳内外引物比例为6：1,最佳dNTPs浓度为1 mmol·L−1。加入160 μM羟基萘酚蓝（HNB）可清晰地指示反应结果,两种检测体系在61 ℃条件下,分别反应30 min和40 min可实现目视判断结果,且灵敏度分别可达34 fg·μL−1和60 fg·μL−1。 结论 通过建立两种锈菌的可视化LAMP-HNB检测体系可实现对北美栅锈菌和松杨栅锈菌进行区分及鉴定,为快速鉴定和区分重要杨树锈病提供了技术支撑和实践参考。     

病原性鳗弧菌(Vibrio anguillarum)双重PCR与LAMP检测方法的建立

本研究检测了分离自发病大菱鲆、半滑舌鳎及鲤鱼的22株病原鳗弧菌(Vibrio anguillarum)毒力相关基因的携带情况,并建立了病原鳗弧菌的分子生物学检测方法。以PCR方法检测8个毒力相关基因的分布,结果显示,22株病原鳗弧菌均可扩增出6个基因(empA、vah1、vah4、flaA、rtxA和tonB)目的条带,未扩增出virA和angM基因;针对vah4和rtxA设计引物进行双重PCR扩增,同一PCR反应体系可扩增出两条目的条带,灵敏度为2.4×103 CFU/ml,对照菌无任何扩增条带;以vah4设计引物进行LAMP扩增,病原鳗弧菌可扩增出阶梯状条带,呈现阳性反应,6株对照菌无阶梯状扩增条带且呈现阴性反应,LAMP扩增灵敏度为2.4×101 CFU/ml。LAMP检测灵敏度是双重PCR的100倍,LAMP技术与PCR比较,操作简便、快速、灵敏度高且不需昂贵仪器,LAMP检测鳗弧菌的方法更适合于养殖生产实际应用。