丽格海棠细菌性叶斑病病菌检测技术

对丽格海棠细菌性叶斑病菌基因组DNA进行PCR扩增,获得其ITS序列.依据该病菌与该属其他细菌ITS 序列的差异,设计特异性引物对XCB(2)/XCB(3),其扩增片段为400bp,由此建立了快速高效检测该病菌的PCR 技术体系.研究根据抗原抗体特异性结合的特点,制备了兔疫细菌抗体血清,建立了体外检测病原细菌的血清学方 法如琼脂糖双向扩散法及间接ELISA法,为丽格海棠细菌性叶斑病的诊断提供了新的重要手段.该研究还比较了 PCR和血清学检测技术的灵敏度差异,结果显示PCR技术检测灵敏度可达27pg/μL,高于血清学检测技术.     

数字RT-PCR技术检测H3N2亚型猪流感病毒方法的建立

试验旨在利用新型荧光探针--分子信标,建立一种检测猪流感病毒的新方法。根据H3N2亚型猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）的H3和N2基因的保守基因序列,分别设计并合成了特异性引物和分子信标探针,利用数字RT-PCR技术检测H3N2亚型SIV。结果显示,该数字RT-PCR检测方法与其他主要相关病毒均不发生交叉反应,重复性良好;对猪H3N2流感病毒而言,最低可检测到10⁶倍稀释的病毒株。数字RT-PCR方法能够对RNA模板定量分析。在H3N2 SIV的鉴定上,数字RT-PCR方法较实时荧光定量PCR方法更灵敏、准确。     

基于E165R基因非洲猪瘟LAMP快速检测方法的建立

【目的】建立特异性好、灵敏度高的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP)快速检测方法，为非洲猪瘟的实时实地快速检测提供参考。【方法】通过对非洲猪瘟病毒多种基因型66个毒株的E165R基因多序列比对，选取相对保守区域设计LAMP引物，并对反应条件及反应体系进行优化。在获得的最优反应条件及体系下考察方法的检测特异性和灵敏性。【结果】选取的LAMP检测靶标235 bp(29～264 bp)在不同基因型ASFV毒株中保守性较好，序列相似度达94.46%～100%;LAMP反应的最佳温度为64℃、时间为35 min、Mg²⁺浓度为8 mmol/L、内外引物比为8︰1、Bst DNA聚合酶量为16 U。建立的ASFV环介导等温扩增检测方法最低检测限为50 copies/μL,较常规PCR检测提高1个数量级，且35 min即可完成扩增反应。LAMP检测方法与猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸道综合症病毒(PR...     

甘薯曲叶病毒PCR-层析试纸条快速检测方法的建立

为了能够快速且同时大批量检测甘薯样本是否感染甘薯曲叶病毒（SPLCV），本研究建立了SPLCV cp基因的PCR-层析试纸条快速检测方法。首先，本研究构建SPLCV cp基因的重组质粒作为阳性对照，并对标记的特异性引物的扩增条件进行优化。结果显示，退火温度为57℃时，特异性扩增效果最佳；特异性检测结果表明，该引物对与甘薯无症状1号病毒（SPSMV-1）、甘薯杆状DNA病毒B(SPBV-B)、甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）、甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）和甘薯潜隐病毒（SPLV）均无交叉反应，表明该引物对具有较高的特异性。其次，本研究构建了PCR-层析试纸条快速检测系统，当抗体包被磁粒时，20μg地高辛单克隆抗体为0.1 mg羧基磁粒的最佳抗体标记量。特异性扩增产物在新构建的层析系统中3 min左右进行可视化检测；灵敏度检测结果表明，该层析系统的最低检测限为0.000 1 ng·μL-1基因组DNA，灵敏度是普通凝胶检测的10倍，说明该系统灵敏度较高。综上，本研究建立的PCR-层析试纸条检测系统具有可视性、灵敏度高、简便快速的特点，且可以同时对大批量的样本进行SPLCV检验，满足了脱毒薯...