蔬菜土传病原菌三重PCR检测体系的建立与应用

【目的】 针对生产中危害严重的3种蔬菜土传病原菌瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）、尖镰孢（Fusarium oxysporum）、大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）,建立三重PCR（triplex PCR）检测体系,为蔬菜土传真菌病害的早期诊断和鉴定提供技术与方法。【方法】 筛选3种病原菌特异性引物组合,通过设定不同的PCR退火温度、引物浓度、循环次数以及延伸时间,探索影响三重PCR扩增的因素,建立蔬菜土传病原菌三重PCR检测体系,并对体系灵敏度进行检测。为了验证建立体系的稳定性,选择2×Taq Master PCR Mix（北京博迈德生物技术有限公司）和TaKaRa Taq酶（大连宝生物工程有限公司）2个不同公司的试剂,分别利用C1000 Touch ^TM型（赛默飞世尔科技有限公司）与Aeris ^TM型（新加坡艺思高科技有限公司）热循环仪进行三重PCR反应,比较检测结果的可重复性。对田间采集的35份病害样本和149份土壤样本,分别进行三重PCR和病原菌分离检测,以确定所建立得三重PCR检测体系的适用性。 【结果】 三重PCR反应体系中引物对AsAPH2B/AsPyF、FOF1/FOR1、VActF/VActR可分别扩增出瓜果腐霉、尖镰孢、大丽轮枝菌长度为163、328和530 bp的特异性目的片段。反应体系（25 μL）：0.12 μmol·L ^-1 AsAPH2B/AsPyF,0.16 μmol·L ^-1 FOF1/FOR1,0.24 μmol·L ^-1 VActF/VActR,2×Taq Master PCR Mix 12.5 μL,退火温度为60.8℃,35个循环。该体系对病原菌纯培养物的检测灵敏度为10 ^-1ng·μL ^-1,对土壤中大丽轮枝菌、尖镰孢和瓜果腐霉的检测灵敏度分别为10 ⁵、10 ⁶个孢子/g土壤和10 ^-2mg菌丝/g土壤。分别采用2×Taq Master PCR Mix和TaKaRa Taq酶,利用C1000 Touch ^TM型和Aeris ^TM型热循环仪进行三重PCR,扩增结果一致,说明三重PCR体系检测稳定性好。对田间采集的病害和土壤样本进行检测,25份病害样本和71份土壤样本中检测出带菌,三重PCR检测与病原菌分离培养结果一致。 【结论】 本研究建立的瓜果腐霉、尖镰孢、大丽轮枝菌三重PCR检测体系具有灵敏度高、稳定性和重复性好的特点,能够快速、准确地检测田间病株及其根围土壤中的瓜果腐霉、尖镰孢、大丽轮枝菌,为蔬菜土传病害的早期预防和流行监测提供了有效的技术手段。     

玉米丝黑穗病菌基因组SSR的信息分析

利用已经公布的玉米丝黑穗病菌基因组测序的结果,对该基因组中基序为2～6碱基的微卫星(SSR)序列进行了系统的分析。结果表明,在已经公布的23条基因组中选择前3条染色体进行分析,共有888个SSR,其总长度为3.512kb,占这3条基因组染色体碱基数的0.068%,平均6.50kb中就分布有一个长度大于15bp的SSR序列。其中,数量最多的为三碱基重复序列,共有SSR数量329个,其次为六碱基重复序列,数量达185个。五碱基重复序列的SSR数量为155个,数量最少的是四碱基重复序列,只有101个。     

韩国大丽轮枝菌形态学及分子生物学特性的初步研究(英文)

通过显微镜观察对大丽轮枝黄萎病菌株进行初步分类,并对该菌种轮枝状分生孢子梗的形态进行详细描述,确认了微菌核的存在。筛选出快速鉴定该菌种的特异性引物Vd3/Vd4。同时,利用10对RAPD引物对实验菌株进行分析,结果表明,轮枝黄萎病菌种间存在着高度的遗传多样性。     

甘蔗黑穗病菌DNA提取及PCR检测

本研究利用尿素混合液直接从甘蔗黑穗病菌孢子提取基因组DNA进行PCR检测鉴定,经过反复试验,建立了一种简便、快速的检测鉴定方法。利用建立的方法对12个甘蔗黑穗病样品进行病菌基因组DNA提取,将甘蔗黑穗病菌特异性引物进行PCR检测,均扩增出大小为420 bp的预期DNA片段条带。PCR扩增产物经克隆测序,与GenBank数据库中的甘蔗黑穗病病原菌序列比对,同源性达99%。     

复合生物保鲜剂对腐败希瓦氏菌的抑菌机理

为了研究复合生物保鲜剂对冷藏带鱼优势腐败菌(腐败希瓦氏菌)的抑菌作用机理,通过牛津杯法测定了复合生物保鲜剂对腐败希瓦氏菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),并测定了复合生物保鲜剂对腐败希瓦氏菌的抑菌活力、细菌生长曲线、细胞膜完整性和细胞的稳定性,对细菌超微结构进行了观察。结果显示:复合生物保鲜剂对腐败希瓦氏菌的MIC与MBC分别为1.6 mg/ml与3.3 mg/ml,且随着作用时间的延长,复合生物保鲜剂对腐败希瓦氏菌的生长有明显抑制作用;尤其经2倍最小杀菌浓度的复合生物保鲜剂处理后,细菌未出现对数生长期;菌液在260 nm处的吸光值明显升高,菌体细胞膜完整性受到破坏;菌体细胞中的碱性磷酸酶升高,菌体细胞壁通透性增大;菌悬液的电导率值明显增大,细胞膜稳定性受损。细菌超微结构观察发现,复合生物保鲜剂作用于菌体细胞后,菌体细胞开始出现皱缩、扭曲变形、表面粗糙和布满泡状物及细胞壁塌陷等现象。表明复合生物保鲜剂可以破坏细菌的细胞内环境和细胞膜稳定性,影响了细菌的正常生长;并且通过影响细菌对营养物质的吸收和代谢物的排出,最终导致菌体死亡。     

瓯柑褐斑病病原鉴定

为鉴定温州和丽水地区所发生的柑橘病害类型,本研究从当地多个果园进行采样,检查和分离培养获得大量的链格孢菌株(Alternaria)。致病性试验证明这些链格孢菌中大部分能够引起类似褐斑症状。对其菌株进行形态学和培养性状的观察,并扩增其多聚半乳糖醛酸酶(endoPG)基因的部分序列进行分析,确定该病害的病原为交链格孢菌(A.alternata(Fr.)Keissler),该病害系柑橘褐斑病。     

蔽果金腰叶内寄生链格孢属真菌特性研究(英文)

[目的]了解虎耳草科植物蔽果金腰内生菌的生物学特性。[方法]利用 PDA 培养基分离蔽果金腰叶内的真菌,利用 PDA 培养基、察氏培养基、改良型 KB 培养基分别对分离得到的菌株进行培养。[结果]菌株在 PDA 培养基、KB 培养基和察氏培养基上均为菌落舒展,白色毡帽状,等径生长,边缘整齐,呈波状,菌落到后期变为青褐色;孢子黑色,在 PDA 培养基上生长在菌落表面,基质呈黑色;而在 KB 培养基和察氏培养基上生长在菌落边缘,基质呈黑色。孢子形态多样,多数为倒棒状,也有球形和椭圆形的,具有纵、横或斜的真隔膜,呈砖格状分隔,喙为短柱状假喙。[结论]分离得到的菌株属于半知菌亚门丝孢纲丝孢目暗色孢科链格胞属真菌的一种。     

山羊痘口服疫苗免疫后对其瘤胃中主要细菌含量的影响

为弄清山羊痘口服疫苗免疫后对山羊的安全性,采用实时定量PCR方法,对山羊免疫后瘤胃中主要细菌的含量进行了测定。结果表明:口服疫苗组山羊瘤胃中白色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌和黄化瘤胃球菌3种纤维分解菌在30d前会产生一定程度的变化,但30d后,瘤胃中的3种纤维分解菌的含量变化与空白对照组差异不显著,口服疫苗未造成瘤胃微生态紊乱,具有较好的安全性。     

水稻病虫害防治要点

1、稻白叶枯病稻白叶枯病是由水稻黄单胞杆菌水稻致病变种侵染引起的细菌病害,症状主要有普通型、急性型、凋萎型。病原物主要在病稻草、稻桩、再生稻、稻种及一些杂草上越冬,次年主要通过流水、风雨传播,从水稻的水孔或伤口处侵染发病。高温、多湿,多台风、暴雨是病害流行的条件。稻田流水串灌、偏施氮肥、土壤酸性等有利于病害发生。防治方法:稻白叶枯病的防治应以控制菌源为前提,以种植抗病品种为基础,秧苗防治为关键,狠抓肥水管理,辅以药剂防治。