G418处理核供体细胞对猪克隆胚胎体外发育效率的影响

【目的】探索G418处理供体细胞对其核移植胚胎发育效率的影响。【方法】利用G418单独处理猪成体成纤维细胞6 d后,收集细胞,利用荧光定量PCR的方法检测处理前后细胞中抗氧化应激、细胞凋亡相关基因的表达水平,运用亚硫酸盐结合测序法分别检测基因组重复序列LINE-1、微卫星的DNA甲基化状态,以及其核移植胚胎体外发育的能力。【结果】经不同质量浓度G418处理的供体细胞的抗氧化应激酶相关基因及细胞凋亡基因表达发生显著变化(P0.05),但其DNA甲基化水平没有发生改变(P0.05);经G418处理的供体细胞的核移植胚胎的体外发育效率显著低于对照组(P0.05)。【结论】G418处理供体细胞可能对其克隆胚胎体外发育效率有抑制作用。     

利用渗透压研究猪卵母细胞发育过程中核迁移规律

本研究采用高渗操作液(氯化钠)处理体外成熟卵母细胞。结果表明,发现培养42 h的卵母细胞,中期核与第一极体刚开始分离。培养44 h的卵母细胞,中期核与第一极体已经分离,达到15°。培养46 h的卵母细胞,中期核与第一极体之间的角度达45°。培养48 h的卵母细胞,中期核与第一极体之间的角度达到近90°,中期核开始向卵母细胞中迁移。经过高渗处理的卵母细胞经过后续操作后可以得到克隆个体。结果表明,利用体外成熟培养42~44 h的卵母细胞进行去核操作,可以达到近100%的去核效率,而不会影响胚胎的正常发育。     

哺乳动物体细胞克隆技术应用的研究进展

哺乳动物体细胞克隆技术是一项高新的生物技术,这一技术不仅为许多学科发展带来了机遇,它的应用将给畜牧业生产、转基因动物和医学带来了革命性的变化。作者就这几个方面的应用做一简要综述。     

牛细胞核移植研究简报

本研究探讨了用体外受精胚胎作供体、体外成熟卵母细胞作受体进行核移植的可能性，比较了两种不同核移植方法的效果。本研究结果在我国首次获得牛核移植的成功。从屠宰场回收的黄牛卵巢中抽取未成熟的卵母细胞，采用以前报道的方法（Ｓｈｉｅｔａｌ，Ｔｈｅｎ－ｏｙｅｎｏｌｏｙ，１９９１，３５；２７１）进行体外成熟（ＩＶＭ）和体外受精（ＩＶＦ），获得ＩＶＭ如母细胞和ＩＶＦ胚胎。体外受精用精液为奶牛精液。在ＩＶＭ２３～２４ｈ＄母细胞去核后用作受体卵，体外发育到８～３２细胞期的ＩＶＦ胚胎用作核供体．去核后的卵母细胞分两组：！．在Ｗ２６ｈ（或３０ｈ）用８０Ｖ／ｍｍ４０μｓ电激活两次，然后注入供体胚胎卵裂球，ＩＶＭ３２ｈ（或３６ｈ）进行电融合；Ⅱ．注卵裂球前不激活，在ＩＶＭ３１ｈ进行电融合。两组融合条件相同（８０Ｖ／ｍｍ４０μｓ×２，间隔１ｓ），融合液为０．３Ｍ甘露醇＋０．０５ｍＭＣａＣｌ２＋０．１ｍＭＭｇＳＯ４＋１０ｍＭ组氨酸。融合印在颗粒细胞单层培养滴内共培养，体外培养２４ｈ后观察卵裂结果。经体外培养５～８ｄ后发育到桑椹和囊胚的核移植胚胎移植到同期发情的受体奶牛子直角内。２个月后直检妊娠情况。本研究结果如下：Ⅰ组操作后存活率（９０．     

山羊-绵羊种间体细胞核移植重构胚构建

以山羊皮肤成纤维细胞为供体细胞,绵羊去核卵母细胞为受体细胞进行种间体细胞核移植,构建山羊-绵羊重构胚,并对其采用离子霉素联合6-DM AP法和胞质注射绵羊精子提取物法进行激活,比较两种不同激活方法对山羊-绵羊种间体细胞核移植重构胚的激活效果。结果表明,共构建获得山羊-绵羊重构胚238枚,重构胚在体外能够发育至囊胚阶段;离子霉素联合6-DM AP法激活的卵裂率为58.33%(70/120),囊胚发育率为4.28%(3/70);胞质注射绵羊精子提取物法激活的卵裂率为63.55%(75/118),囊胚发育率为6.66%(5/75),两种方法的激活效果差异不显著。     

利用体细胞核移植技术生产表达绿色荧光蛋白转基因猪胚胎的研究

试验对脂质体转染猪胎儿成纤维细胞的技术程序进行了筛选,以绿色荧光蛋白基因转染后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体,以体外成熟卵母细胞为核受体构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎,并对重构胚在体外发育情况以及绿色荧光蛋白表达情况进行了跟踪研究。结果显示,采用4.0μg.mL-1脂质体转染试剂,1.6μg.mL-1质粒DNA,转染6 h可以获得最佳转染效果,转染效率达4.48%;GFP转基因体细胞重构胚体外囊胚发育率为10%,GFP阳性胚胎率为48%。结果表明,脂质体转染试剂可以高效转染猪胎儿成纤维细胞,获得的阳性细胞具有支持猪全程发育的潜能。     

CCB、蔗糖及成熟时间对山羊卵母细胞去核效果的影响

分离培养山羊卵母细胞,采用盲吸法去核,研究不同成熟培养时间(18,22和26 h)不同细胞松弛素B(CCB)浓度(5,7.5,10,15 mg/L)和不同蔗糖浓度(20,25,30 g/L)对卵母细胞去核效果的影响。结果表明,山羊卵母细胞最佳去核条件为:卵母细胞体外成熟时间为22 h,去核时操作液中CCB质量浓度为7.5 mg/L,蔗糖质量浓度为20 g/L。     

体细胞核移植技术生产转入溶菌酶基因(hLYZ)牛胚胎的研究

本研究主要探讨经基因修饰和筛选后转基因供体细胞的挑选及处理对牛转入溶菌酶基因克隆胚胎早期发育的影响.用含人溶菌酶基因(human lysozyme,hLYZ)乳腺特异表达载体pEBH重组质粒转染高产荷斯坦牛成纤维细胞,经G418筛选后的转基因阳性细胞作为核供体细胞成功构建了转hLYZ基因克隆胚胎.结果发现,基因转染及筛选过程对转基因重构胚的发育有不利的影响,囊胚发育率显著降低;以注核针内径为参照,挑选直径为15～20μm的转基因阳性细胞作为供体细胞,重构胚的融合率和囊胚率较其它组差异显著(分别为80.4%和33.8%,P<0.05);生长旺盛期的细胞构建的转基因克隆胚的卵裂率及囊胚发育率显著高于经血清饥饿和生长接触抑制处理组(P＜0.05);所有的转基因克隆胚在体外发育的各个发育时期都能观察到绿色荧光蛋白的表达,但表达的强弱在不同个体及相同个体不同发育时期之间存在差异.随机挑选10枚囊胚以PCR法进行鉴定,结果全部为阳性转基因胚胎.研究结果表明,利用体细胞核移植方法可以获得转舰hLYZ基因的克隆胚胎,重构胚可成功的发育到囊胚阶段;挑选生长旺盛期的直径为15～20 μm的转基因阳性细胞作为供体细胞可显著提高转基因克隆胚的融合率和囊胚率.     

用超低温保存的囊胚细胞进行核移植试验

对超低温冷冻保存囊胚细胞的方法、保护剂的选用以及核移植的效果进行了初步研究.利用超低温冷冻保存的囊胚细胞进行核移植是解决核移植中供体与受体时间配合的一种有效方法。     

TSA处理供体细胞或重构胚对山羊克隆胚胎发育的影响

本研究探讨了TSA处理供体细胞或重构胚对山羊克隆胚胎发育的影响,不处理组设为对照组.选择经5、25、50、75、100 nmol·L-1 TSA处理24 h的山羊胎儿成纤维细胞作为供体细胞进行核移植,结果50和75nmol·L-1组的囊胚率显著高于对照组(27.34%、26.89%VS 16.18%,P<0.05);用5、25、50、75或100 nmol·L-1TSA处理重构胚10 h,结果5、25、50、75 nmol·L-1组的囊胚率均有所提高,其中50 nmol·L-1组显著高于对照组(27.34%VS 16.53%,P<0.05).结果表明,TSA处理供体细胞和重构胚均能显著提高山羊克隆胚囊胚率,说明TSA可能降低了核移植后供体细胞组蛋白去乙酰化水平和DNA甲基化水平,因而提高了克隆胚的发育率.