体细胞核移植技术生产转入溶菌酶基因(hLYZ)牛胚胎的研究

本研究主要探讨经基因修饰和筛选后转基因供体细胞的挑选及处理对牛转入溶菌酶基因克隆胚胎早期发育的影响.用含人溶菌酶基因(human lysozyme,hLYZ)乳腺特异表达载体pEBH重组质粒转染高产荷斯坦牛成纤维细胞,经G418筛选后的转基因阳性细胞作为核供体细胞成功构建了转hLYZ基因克隆胚胎.结果发现,基因转染及筛选过程对转基因重构胚的发育有不利的影响,囊胚发育率显著降低;以注核针内径为参照,挑选直径为15～20μm的转基因阳性细胞作为供体细胞,重构胚的融合率和囊胚率较其它组差异显著(分别为80.4%和33.8%,P<0.05);生长旺盛期的细胞构建的转基因克隆胚的卵裂率及囊胚发育率显著高于经血清饥饿和生长接触抑制处理组(P＜0.05);所有的转基因克隆胚在体外发育的各个发育时期都能观察到绿色荧光蛋白的表达,但表达的强弱在不同个体及相同个体不同发育时期之间存在差异.随机挑选10枚囊胚以PCR法进行鉴定,结果全部为阳性转基因胚胎.研究结果表明,利用体细胞核移植方法可以获得转舰hLYZ基因的克隆胚胎,重构胚可成功的发育到囊胚阶段;挑选生长旺盛期的直径为15～20 μm的转基因阳性细胞作为供体细胞可显著提高转基因克隆胚的融合率和囊胚率.     

点压去核法对猪体细胞核移胚发育影响

卵母细胞的去核是细胞核移植过程中的关键环节。在核移植研究中，卵母细胞的去核程度与重组胚再程序化的状态密切相关，去核效率高，其克隆胚胎最终发育成正常个体的可能性越大。去核步骤仍是胚胎克隆技术中最耗时间的步骤之一。本研究比较了三种去核方法。     

徒手切割法体细胞克隆研究进展

体细胞核移植技术目前主要局限性是需要显微操作仪以及相关设备,并且对技术人员也有较高要求。徒手切割法体细胞克隆(HM C)技术不需要显微操作,且对技术人员要求也不高,是一项手工化的核移植技术,对今后核移植技术的研究以及产业化的发展具有一定的推动作用。     

EGF和不同血清对牛卵母细胞成熟及核移植胚体外发育的影响

分离牛卵母细胞,分别用添加表皮生长因子(EGF)和发情牛血清(发情当天血清(OCS(0 d))和发情第7天血清(OCS(7 d)))的培养液进行成熟培养后去核,构建牛体细胞核移植胚并进行体外培养,研究EGF和OCS对卵母细胞成熟及核移植胚体外发育的影响。结果表明EGF添加组和OCS(0 d)添加组卵细胞的成熟率及核移植胚的卵裂率和囊胚率分别为74.5%,84.6%,25.9%和83.9%,78.8%,31.3%。在牛卵母细胞成熟液中添加EGF、OCS(0 d)更有利于牛核移植胚胎的发育。     

牛细胞核移植研究简报

本研究探讨了用体外受精胚胎作供体、体外成熟卵母细胞作受体进行核移植的可能性，比较了两种不同核移植方法的效果。本研究结果在我国首次获得牛核移植的成功。从屠宰场回收的黄牛卵巢中抽取未成熟的卵母细胞，采用以前报道的方法（Ｓｈｉｅｔａｌ，Ｔｈｅｎ－ｏｙｅｎｏｌｏｙ，１９９１，３５；２７１）进行体外成熟（ＩＶＭ）和体外受精（ＩＶＦ），获得ＩＶＭ如母细胞和ＩＶＦ胚胎。体外受精用精液为奶牛精液。在ＩＶＭ２３～２４ｈ＄母细胞去核后用作受体卵，体外发育到８～３２细胞期的ＩＶＦ胚胎用作核供体．去核后的卵母细胞分两组：！．在Ｗ２６ｈ（或３０ｈ）用８０Ｖ／ｍｍ４０μｓ电激活两次，然后注入供体胚胎卵裂球，ＩＶＭ３２ｈ（或３６ｈ）进行电融合；Ⅱ．注卵裂球前不激活，在ＩＶＭ３１ｈ进行电融合。两组融合条件相同（８０Ｖ／ｍｍ４０μｓ×２，间隔１ｓ），融合液为０．３Ｍ甘露醇＋０．０５ｍＭＣａＣｌ２＋０．１ｍＭＭｇＳＯ４＋１０ｍＭ组氨酸。融合印在颗粒细胞单层培养滴内共培养，体外培养２４ｈ后观察卵裂结果。经体外培养５～８ｄ后发育到桑椹和囊胚的核移植胚胎移植到同期发情的受体奶牛子直角内。２个月后直检妊娠情况。本研究结果如下：Ⅰ组操作后存活率（９０．     

Scriptaid处理可提高近交系五指山猪克隆胚胎的发育能力和克隆效率

为探讨一种新型低毒的组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid处理克隆胚胎时对其发育能力和克隆效率的影响,本研究以近交系五指山小型猪胎儿成纤维细胞为供体细胞进行体细胞核移植构建重构胚胎,重构胚胎激活后培养在添加Scriptaid不同浓度（0～300nmol/L）的胚胎培养液中培养不同的时间（0～36h）,观察克隆胚胎的卵裂率和囊胚率,评价克隆胚胎体外的发育能力。实验结果发现100nmol/L Scriptaid处理24h组克隆胚胎的囊胚发育率（30.4%）较对照组（17.5%）显著提高,P〈0.05。将100nmol/L Scriptaid处理24h组克隆胚胎和对照组胚胎分别移植到4头受体母猪中,进一步观察其体内的发育能力。处理组克隆胚胎的受体在平均窝产仔数和克隆效率（分别为5头,2.4%）均显著高于对照组（分别为1.5头,0.7%）,P〈0.05。以上结果表明,100nmol/L Scriptaid处理24h近交系五指山小型猪克隆胚胎,有利于提高克隆胚胎的发育能力和克隆效率。     

水牛体细胞连续核移植的效果

为探讨水牛体细胞连续核移植的效果,以水牛胎儿成纤维细胞为核供体,进行了水牛体细胞连续核移植。结果显示,连续核移植的融合率显著高于原代核移植(87.9%vs76.2%,P<0.05),但两者之间的分裂率和囊胚率没有显著差异(P>0.05);这说明水牛体细胞核移植胚胎可被再次克隆而不降低其发育能力,水牛体细胞连续核移植是可行的。     

cDNA Cloning of Goat DNA Methyltransferase 1,Screening of shRNA Vectors and Influences to Development of Nuclear Transfer Embryos

This study was designed to clone cDNA of goat DNA methyltransferase 1（DNMT1） gene,to screen an effective shRNAproducing vector targeting goat DNA methyltransferase 1 and to improve the developmental competence of goat nuclear transfer embryos by decreasing the DNMT1 expression in donor cells.In this study,PCR primers were designed against regions of high homology between bovine and sheep sequences and then used to amplify the larger portions of the coding regions.Next,3 RNAi oligonucleotides were designed based on the cloned sequences and inserted into pRNAT-U6.1/Neo vector,acquiring 3 new vectors,respectively termed pRNAD1,pRNAD2 and pRNAD3.Then the positive cells were sorted by flow cytometry after transfection and detected by real-time PCR analysis and sodium bisulfite genomic sequencing.Finally,the developmental rates of nuclear transfer（NT） embryos generated using donor cells with and without the effective shRNA vector respectively,as well as in vitro fertilization（IVF） embryos were observed and recorded.The results showed that the coding regions of goat DNA methyltransferase 1 gene was successfully cloned（GenBank no.FJ617538）.Furthermore,an effective interfering shRNA（pRNAD2） was obtained,with its interference effect being 47.88%.Finally,NT embryos with shRNA vector harbored better developmental competence during morula and blastocyst stage compared to controls（P 〈 0.05）,reaching the similar rates to IVF embryos（P 〉 0.05）.In conclusion,goat DNA methyltransferase 1 gene cDNA was cloned and sequenced,an effective shRNA vector responsible for inhibiting DNA methyltransferase 1 expression was developed and the developmental competence of goat nuclear transfer morulae and blastcysts was significantly improved,which provided a feasible pathway for improving goat nuclear transfer embryo development competence by decreasing the methylation level in donor cells through RNAi-mediated manner.     

哺乳动物胚胎核移植

1981年瑞士日内瓦大学的Illmensee用受精卵核移植技术,首次制成了无性生殖小鼠,即所谓的“克隆小鼠”。随后不到10年时间,绵羊(Willadsen,1986)、牛(Prather等,1987)、家兔(Stice和Robl,1988)、猪(Prather等,1989)等家畜都成功地通过核移植方法获得了无性生殖后代。目前,哺乳动物的这一“复制”技术虽还不能即刻应用于生产,但可通过核移植来培育遗传性状完全一致的个体,这在畜牧科学或其他生命科学研究中会起举足轻重的作用。下面就此技术的一般程序和在家畜方面的成功经验作一简述。