点压去核法对猪体细胞核移胚发育影响

卵母细胞的去核是细胞核移植过程中的关键环节。在核移植研究中，卵母细胞的去核程度与重组胚再程序化的状态密切相关，去核效率高，其克隆胚胎最终发育成正常个体的可能性越大。去核步骤仍是胚胎克隆技术中最耗时间的步骤之一。本研究比较了三种去核方法。     

体细胞核移植技术在转基因动物研究中的应用

利用基因工程技术将目的基因整合入动物体细胞染色体中，并将其作为供体核移植入受体－－去核卵母细胞构成重建胚，然后将其移植入假孕母体，待其妊娠、分娩，便可得到经定向遗传修饰的转基因克隆动物。本文就这一领域的发展历史、研究现状、应用前景及存在的问题等方面作一概述。     

细胞周期对核移胚发育的影响

本文综述了近年细胞周期与核移胚发育能力关系的有关研究，供体细胞周期对核移胚的发育有着重要的影响。以新鲜卵母细胞为受体，采用不排出第二极体（ｐｂ２）的激活方法（如电激）时，核移胚的发育以Ｇ１供体最好，Ｓ，Ｇ２核发育能力降低；采用排出ｐｂ２的激活方法（如酒粗）时，Ｇ２核发育能力最强。激活后的卵母细胞做受体也可重排供体核，核周期对核移胚的发育可能影响不大。但尚需实践证明。     

猪克隆技术的最新进展

猪克隆的生产技术体系不仅对增加优良猪种的生产有重要意义 ,而且对于不带有抗体的能够进行器官异种移植的动物生产和对离体人类基因功能的分析也有重要的意义。但目前还没有建立和完善这一克隆体系。我们试着将培养的细胞移植到去核的卵母细胞中来生产克隆猪 ,并且已经获得一些克隆胚胎。为了建立一个克隆猪的生产体系 ,人们需要不断完善和提高基本的技术和技能     

不同类型供体细胞对牛体细胞重构胚发育能力的影响

通过显微操作去除体外成熟培养22￣23h卵母细胞的细胞核,并通过细胞质内注射法将供体细胞核移入去核卵母细胞内构建重组胚,重组胚经离子霉素(Ionomycin)激活5min后,再在6-DMAP内培养4h,将重组胚转CR1培养液中进行培养,24h和36h检查卵裂率,培养8d后统计囊胚发育率。比较了经血清饥饿和未饥饿牛成纤维细胞、颗粒细胞作为供体细胞构建的重组胚。研究发现:未饥饿组的牛成纤维细胞重组胚囊胚发育率(11.76%)显著高于血清饥饿组重组胚囊胚发育率(3.16%,p<0.05)。未饥饿组颗粒细胞囊胚发育率(14.94%)也显著高于血清饥饿组(7.14%,p<0.05)。经血清饥饿处理的颗粒细胞和成纤维细胞重组胚发育率差异不显著(p>0.05),未饥饿处理组两种细胞的重组胚发育率差异不显著。结果表明,用非饥饿处理牛成纤维细胞及颗粒细胞重组胚的发育率较高,牛颗粒细胞更有利于重新程序化。     

EGF和不同血清对牛卵母细胞成熟及核移植胚体外发育的影响

分离牛卵母细胞,分别用添加表皮生长因子(EGF)和发情牛血清(发情当天血清(OCS(0 d))和发情第7天血清(OCS(7 d)))的培养液进行成熟培养后去核,构建牛体细胞核移植胚并进行体外培养,研究EGF和OCS对卵母细胞成熟及核移植胚体外发育的影响。结果表明EGF添加组和OCS(0 d)添加组卵细胞的成熟率及核移植胚的卵裂率和囊胚率分别为74.5%,84.6%,25.9%和83.9%,78.8%,31.3%。在牛卵母细胞成熟液中添加EGF、OCS(0 d)更有利于牛核移植胚胎的发育。     

徒手切割法体细胞克隆研究进展

体细胞核移植技术目前主要局限性是需要显微操作仪以及相关设备,并且对技术人员也有较高要求。徒手切割法体细胞克隆(HM C)技术不需要显微操作,且对技术人员要求也不高,是一项手工化的核移植技术,对今后核移植技术的研究以及产业化的发展具有一定的推动作用。     

6-DMAP对延边黄牛末期卵母细胞核移植的影响

为探讨6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）在延边黄牛末期去核的体细胞克隆中的作用,本试验主要研究了单独使用离子霉素处理与离子霉素联合添加6-DMAP处理对体外成熟的老化延边黄牛卵母细胞的激活率的不同影响;以及不同时期添加6-DMAP对重构胚后期发育能力的影响。试验结果显示,体外成熟的老化卵母细胞,使用离子霉素单独处理后91%被激活,而在离子霉素联合添加6-DMAP处理后却没有细胞被激活,也就是没有第二极体的排出。另外,融合后使用6-DMAP处理,所得重构胚的囊胚发育率最低,而激活后的卵母细胞立即用6-DMAP处理,所得重构胚的发育能力与无6-DMAP处理的相近。综上所述,离子霉素联合添加6-DMAP可抑制老化的延边黄牛卵母细胞的激活,阻止第二极体的排出,但对重构胚的后期发育没有影响。而融合使用添加6-DMAP的培养液,抑制了重构胚的后期发育。     

携带人Ⅰ型а1原胶原基因荷斯坦奶牛胚胎的发育研究

克隆了人Ⅰ型а1原胶原的cDNA基因,将克隆的基因连接到改造后的乳腺特异性表达载体pGC1上,经电穿孔法转染到成纤维细胞中,利用核移植技术获得携带人Ⅰ型а1原胶原基因牛胚胎。最终获得8枚转基因的囊胚,证明用核移植方法获得的携带人Ⅰ型а1原胶原蛋白基因的荷斯坦奶牛胚胎能够正常发育。     

亮甲酚蓝对猪卵母细胞体外成熟及核移植胚胎发育能力的影响

试验旨在研究亮甲酚蓝(brilliant cresyl blue,BCB)染色对卵母细胞体外成熟及后期胚胎发育潜力的影响。本研究利用13、26、39 、52 μmol/L BCB对成熟培养前的卵丘－卵母细胞复合体(cumulus-oocyte-complexes,COCs)染色90 min,比较各组卵母细胞的着色率、成熟率及孤雌激活胚胎和核移植胚胎的发育情况。结果表明,随着BCB浓度的增加,COCs着色率依次增加(20.00%、46.39%、51.66%和59.03%),但猪卵母细胞体外成熟率逐渐降低(74.03%、72.16%、70.53%和48.61%);不同浓度BCB染色后所得BCB⁺组卵的成熟率均明显高于BCB^-组。试验结果发现,BCB浓度在26 μmol/L时,经染色的COCs既有较高的着色率,且不影响其体外成熟的效率。基于此,研究选取26 μmol/L BCB作为最佳浓度对猪卵母细胞进行染色筛选,然后进行体外培养、孤雌激活及核移植试验。结果显示,筛选的BCB⁺组卵母细胞的孤雌胚和核移植胚的卵裂率和囊胚率均显著高于BCB^-组(P<0.05),而与对照组间无显著差异(P>0.05)。胚胎移植试验挑选BCB⁺组中发育较好的1-2细胞期重组胚对5头代孕母猪进行了移植,其中2头怀孕,1头顺利产下了6头健康胎儿。综合以上试验结果表明,利用BCB染色可作为一种有效的方法筛选体外成熟质量较高的猪卵母细胞,同时提高胚胎体外生产效率。