牦牛异种核移植显微操作针的制备

结合制备用于牦牛异种核移植显微操作针的经验,介绍了制备显微操作用针的具体方法,并对一些在显微操作针制作过程中可能出现的影响因素及其注意事项加以总结。     

利用成年母兔耳部皮肤上皮细胞生产克隆胚胎的研究

以成年母兔耳部皮肤上皮细胞为核供体,对家兔体细胞核移植技术中融合、激活以及不同来源受体卵母细胞的选择等环节进行了研究,比较了不同电场强度对重构胚胎融合率、分裂率的影响。结果表明,200V/mm电场强度时重构胚胎的融合率(82.53%)显著高于160V/mm(59.73%),但与240V/mm(79.56%)无显著差异;200V/mm时重构胚胎的分裂率(71.43%)显著高于160V/mm(49.43%)和240V/mm(57.80%)。来源于输卵管卵母细胞组成的重构胚胎的融合率(84.71%)和裂解数与来源于卵巢大卵泡(78.75%)的无显著差异;但来源于输卵管的重构胚胎分裂率(73.68%)显著高于来源于卵巢大卵泡的(56.35%)。将646枚2~4细胞期重构胚移植到38只同期化及非同期化的受体后无幼仔出生。     

脂质体介导的鲫CAB细胞转化及转化细胞的核移植

采用脂质体法成功地使gfp基因转入鲫囊胚细胞株CAB细胞基因组，获得了具有G418抗性的细胞。以转化细胞为供体，银鲫卵为受体，核移植得到了转基因的囊胚和原肠胚；并发现4℃处理细胞24h能显著改善核移植胚胎的发育。     

Scriptaid处理可提高近交系五指山猪克隆胚胎的发育能力和克隆效率

为探讨一种新型低毒的组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid处理克隆胚胎时对其发育能力和克隆效率的影响,本研究以近交系五指山小型猪胎儿成纤维细胞为供体细胞进行体细胞核移植构建重构胚胎,重构胚胎激活后培养在添加Scriptaid不同浓度（0～300nmol/L）的胚胎培养液中培养不同的时间（0～36h）,观察克隆胚胎的卵裂率和囊胚率,评价克隆胚胎体外的发育能力。实验结果发现100nmol/L Scriptaid处理24h组克隆胚胎的囊胚发育率（30.4%）较对照组（17.5%）显著提高,P〈0.05。将100nmol/L Scriptaid处理24h组克隆胚胎和对照组胚胎分别移植到4头受体母猪中,进一步观察其体内的发育能力。处理组克隆胚胎的受体在平均窝产仔数和克隆效率（分别为5头,2.4%）均显著高于对照组（分别为1.5头,0.7%）,P〈0.05。以上结果表明,100nmol/L Scriptaid处理24h近交系五指山小型猪克隆胚胎,有利于提高克隆胚胎的发育能力和克隆效率。     

丁内酯-Ⅰ影响猪卵母细胞的体外成熟和发育能力

体外成熟的卵母细胞存在核成熟与胞质成熟不一致的情况,从而使得体外成熟的卵母细胞质量不高.本实验采用cdc2激酶抑制剂丁内酯-Ⅰ (butyrolactone Ⅰ,BL-Ⅰ)抑制猪卵母细胞核体外成熟,期望解决卵母细胞体外培养过程中细胞核与细胞质发育的不同步问题.结果表明,分别用0、10、20、40和80 μmol/LBL-Ⅰ处理猪卵母细胞44 h后,对卵母细胞成熟的抑制程度与BL-Ⅰ浓度的升高成正比.用20、40和80μmol/L处理时,处于生发泡(GV)期的卵母细胞分别为25％、47％和67％,与对照组(5％)相比差异极显著(P＜0.01);而到达MⅡ期的卵母细胞分别为38％、9％和0,与对照组(67％)相比差异极显著(P＜0.01).将20、40和80 μmol/L处理44 h后的卵母细胞,再在不含BL-Ⅰ的卵母细胞体外成熟培养液中培养44 h后,到达MⅡ期的卵母细胞为57％、41％和5％,与抑制44 h时相比均有显著差异,表明BL-Ⅰ对卵母细胞成熟的抑制作用是可逆的.20 μmol/L BL-Ⅰ抑制培养20 h再正常培养24 h(20 h++24 h-处理组)后卵母细胞的成熟率显著低于对照组(正常培养44 h)(65.6％vs 70.1％,P＜0.05).对20 h++24 h-处理组成熟的卵母细胞进行孤雌激活,其卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数均好于对照组,但无显著差异;对20 h++24 h-处理组成熟的卵母细胞进行核移植(NT),获得重构胚的卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数均优于对照组,并且卵裂率有显著差异(68.9％vs 62.4％,P＜0.05).结果提示BL-Ⅰ处理对猪卵母细胞的核成熟有明显抑制作用,这种抑制作用是可逆的,对猪卵母细胞孤雌胚胎发育能力和核移植胚胎的发育能力有一定的提高.     

兔核移植胚胎的克隆研究

本研究改进了兔受体卵母细胞的去核程序及供体卵裂球的处理方法，并对核移植胚的体外克隆、继代克隆及克隆胚的体内发育进行了试验。结果表明：卵龄对受体卵母细胞的去核具有显著的影响，卵龄为１５～１８ｈ的去核率为１００％（４５／４５），显著高于１３～１４ｈ的４６．６％（７／１５），Ｐ＜０．０１。ＤＮＡ合成抑制剂Ａｐｈｉｄｉｃｏｌｉｎ处理１６－细胞期卵裂球后，重组胚的囊胚发育率５４％（２０／３７）高于未处理组的４５％（１４／３１），Ｐ＜０．０５。从２枚１６－细胞供体胚分别获得来自一个供体胚的９枚和７枚核移植克隆囊胚，囊胚发育率为５１．６（１６／３１）。然而第一次继代核移植胚的囊胚发育率仅为１１．５％（６／５２）。１６－及３２－细胞期卵裂球的重组胚可发育至产仔，共获２窝８只仔兔。其中１只、２只、２只和３只仔兔分别来自４个供体胚。     

草鱼与青鱼,鳙鱼与团头舫之间的细胞核移植

在草鱼与青鱼、鳙鱼与团头鲂之间进行了核移植试验，获得了不同属鱼类间的草鱼细胞核和青鱼细胞质配合的核质杂种鱼－草青移核鱼幼鱼，以及不同亚科间的鳙鱼细胞核与团头鲂细胞质配合的核质杂种鱼－鳙团移核鱼，得率分别为０．９％和１．８％。核质杂种鱼的胚胎发育特征大多与受核体鱼相似，而形态特征大多与供核体鱼相似，表明胚胎发育明显受受核体细胞质的影响，而形态性状特征主要受供核体细胞核的影响。     

哺乳动物胚胎核移植

1981年瑞士日内瓦大学的Illmensee用受精卵核移植技术,首次制成了无性生殖小鼠,即所谓的“克隆小鼠”。随后不到10年时间,绵羊(Willadsen,1986)、牛(Prather等,1987)、家兔(Stice和Robl,1988)、猪(Prather等,1989)等家畜都成功地通过核移植方法获得了无性生殖后代。目前,哺乳动物的这一“复制”技术虽还不能即刻应用于生产,但可通过核移植来培育遗传性状完全一致的个体,这在畜牧科学或其他生命科学研究中会起举足轻重的作用。下面就此技术的一般程序和在家畜方面的成功经验作一简述。