动物克隆技术研究现状及其应用前景

动物克隆技术研究现状及其应用前景王锋（南京农业大学动物科技学院２１００９５）１９９７年初,苏格兰Ｒｏｓｌｉｎ研究所的科学家借助核移植技术,利用成年母羊的乳腺细胞成功地“复制”出一只名叫“多莉”的雌性小绵羊,这一划时代的科技成果震动了整个世界,科学家及...     

水牛体细胞连续核移植的效果

为探讨水牛体细胞连续核移植的效果,以水牛胎儿成纤维细胞为核供体,进行了水牛体细胞连续核移植。结果显示,连续核移植的融合率显著高于原代核移植(87.9%vs76.2%,P<0.05),但两者之间的分裂率和囊胚率没有显著差异(P>0.05);这说明水牛体细胞核移植胚胎可被再次克隆而不降低其发育能力,水牛体细胞连续核移植是可行的。     

哺乳类动物胚胎干细胞多能性和全能性研究进展

交ＥＳ细胞分离与克隆技术和分子生物学技术相结合就可将新的遗传物质导入家畜的生殖腺细胞。通过囊胚注入胚胎干细胞产生嵌合体小鼠表明对胚胎干细胞进行遗传操作是对物生殖细胞进行遗传改造的有效方法之一。     

牛繁殖技术的新进展

动物繁殖技术是生物技术的重要分支。繁殖技术从20世纪50年代人工授精技术到20世纪70年代胚胎移植技术的应用,似乎才真正开始动物繁殖技术的新纪元。牛的繁殖技术在过去的50年里取得了显著进展,这是一个以人工授精起始的连续过程。随着体外受精、精子分离和核移植（克隆）等技术的发展,这些连续性的繁殖技术将是目前和未来提高生产力的强有力手段。     

成熟培养基对猪卵母细胞的影响

评估NCSU23和TCM199两种培养基对猪卵母细胞体外成熟、孤雌激活以及核移植重构胚发育的影响。分别以NCSU23和TCM199为基础培养基,向其中添加相同浓度的半胱氨酸、激素和生长因子,作为猪卵母细胞体外成熟培养液,培养44 h(5%CO2、39℃、饱和湿度),挑选第一极体;成熟后的卵母细胞进行孤雌激活和核移植重构胚操作,144 h后观察囊胚数。结果表明,NCSU23组与TCM199组对卵母细胞体外成熟(68.18%和67.55%)、孤雌囊胚率(38.40%和37.60%)与核移植囊胚率(23.79%和21.38%)无显著影响(P>0.05),但是两者对孤雌囊胚细胞数的影响差异显著(分别为38.4和37.6个细胞)(P<0.05)。NCSU23成熟培养基能够使胞质成熟完全,提高囊胚细胞数,有利于妊娠的发生。可见,以NCSU23为基础培养基的体外成熟液有利于猪卵母细胞体外发育。     

cDNA Cloning of Goat DNA Methyltransferase 1,Screening of shRNA Vectors and Influences to Development of Nuclear Transfer Embryos

This study was designed to clone cDNA of goat DNA methyltransferase 1（DNMT1） gene,to screen an effective shRNAproducing vector targeting goat DNA methyltransferase 1 and to improve the developmental competence of goat nuclear transfer embryos by decreasing the DNMT1 expression in donor cells.In this study,PCR primers were designed against regions of high homology between bovine and sheep sequences and then used to amplify the larger portions of the coding regions.Next,3 RNAi oligonucleotides were designed based on the cloned sequences and inserted into pRNAT-U6.1/Neo vector,acquiring 3 new vectors,respectively termed pRNAD1,pRNAD2 and pRNAD3.Then the positive cells were sorted by flow cytometry after transfection and detected by real-time PCR analysis and sodium bisulfite genomic sequencing.Finally,the developmental rates of nuclear transfer（NT） embryos generated using donor cells with and without the effective shRNA vector respectively,as well as in vitro fertilization（IVF） embryos were observed and recorded.The results showed that the coding regions of goat DNA methyltransferase 1 gene was successfully cloned（GenBank no.FJ617538）.Furthermore,an effective interfering shRNA（pRNAD2） was obtained,with its interference effect being 47.88%.Finally,NT embryos with shRNA vector harbored better developmental competence during morula and blastocyst stage compared to controls（P 〈 0.05）,reaching the similar rates to IVF embryos（P 〉 0.05）.In conclusion,goat DNA methyltransferase 1 gene cDNA was cloned and sequenced,an effective shRNA vector responsible for inhibiting DNA methyltransferase 1 expression was developed and the developmental competence of goat nuclear transfer morulae and blastcysts was significantly improved,which provided a feasible pathway for improving goat nuclear transfer embryo development competence by decreasing the methylation level in donor cells through RNAi-mediated manner.     

提高兔核移植胚胎体外发育率的研究

 本研究首先比较了不同培养液维持兔胚体外发育的作用，以及多种卵母细胞去核显微操作的去核效率，建立了高效的体外培养体系及去核方法。然后对16-细胞期卵裂球的细胞周期及核移植（Nuclear transplantation,NT）胚的核质比对发育的影响进行了试验，结果表明：G#-1期NT胚的发育率优于G#-2期NT胚（P<0.01）。当G#-1期NT胚的核质比等于卵母细胞时，78.5%(73/93)可在兔眼球玻璃体液(Rabbit vitreous humor,RVH)中发育至囊胚期。这是迄今为止，在动物胚细胞核移植试验中所获得的最高发育率。     

脱羰秋水仙碱(DM)辅助去牛卵母细胞核的研究

受体细胞去核是核移植关键步骤之一。利用脱羰秋水酰碱（Demecolcine,DM）显示牛卵母细胞染色体的位置进行去核,主要从以下几个方面进行了试验：卵母细胞在DM中孵育浓度、卵母细胞在DM中孵育时间及卵母细胞成熟时间对显示效果的影响。结果表明：（1）成熟牛卵母细胞用离子霉素激活5 min,DM孵育2 h完全诱导去核,结果没有见到完全去核的卵母细胞;（2）挑选有第一极体的成熟牛卵母细胞,在浓度为0.5μg/mL的DM中孵育2 h显示率可达76.54%;（3）牛卵母细胞在成熟18 h可以获得73.86%的显示效果。（4）在没有去卵丘细胞的卵母细胞中添加DM取得了更好的显示效果（80.82%）,囊胚的发育率也较其它组高,可达18.60%,说明未去卵丘细胞的卵母细胞添加DM更有利于显示染色体的位置,而且更有利于囊胚的发育。利用DM显示染色体的位置不仅可以高效快速的去核,同时也避免了传统去核时荧光对卵母细胞的照射。     

供体细胞的不同处理方法对牛核移植重构胚发育能力的影响

为了研究供体细胞不同的处理方法对核移植重构胚的作用，比较了用于保种的冻存和新鲜的成纤维细胞做供体细胞、供体细胞不同的离心转数、供体细胞不同的血清饥饿时间及用本实验室冻存的成纤维细胞，解冻复苏后，不同传代次数对重构胚的影响。结果表明分别用冷冻保存的和新鲜的成纤维细胞作为核供体，所得重构胚卵裂率、囊胚率无显著差（P>0.05）；供体细胞离心800 r/min时所得重构胚效果较好，离心1500 r/min所得重构胚的卵裂率、囊胚率与其他3组相比较低；血清饥饿3～5 d组所得重构胚比其他3组好；用解冻复苏后再传2、5代的细胞进行核移植，所得重构胚的卵裂率、囊胚率无明显差异(P>0.05)，显著高于传8代的细胞所得重构胚。说明供体细胞的不同处理方法对核移植重构胚发育有很重要的影响。     

不同来源供体细胞及含羞草素对水牛体细胞核移植的影响

本文主要探讨供体细胞类型及含羞草素对水牛体细胞克隆的影响。结果如下:与成纤维细胞相比,卵丘/颗粒细胞可以获得较高的融合率和分裂率,但两者的囊胚率差异不显著;克隆水牛的成纤维细胞能用于核移植,而且对核移植结果没有影响;性别对重构胚的早期发育影响不大;含羞草素处理可以替代血清饥饿处理。