动物克隆技术研究现状及其应用前景

动物克隆技术研究现状及其应用前景王锋（南京农业大学动物科技学院２１００９５）１９９７年初,苏格兰Ｒｏｓｌｉｎ研究所的科学家借助核移植技术,利用成年母羊的乳腺细胞成功地“复制”出一只名叫“多莉”的雌性小绵羊,这一划时代的科技成果震动了整个世界,科学家及...     

水牛体细胞连续核移植的效果

为探讨水牛体细胞连续核移植的效果,以水牛胎儿成纤维细胞为核供体,进行了水牛体细胞连续核移植。结果显示,连续核移植的融合率显著高于原代核移植(87.9%vs76.2%,P<0.05),但两者之间的分裂率和囊胚率没有显著差异(P>0.05);这说明水牛体细胞核移植胚胎可被再次克隆而不降低其发育能力,水牛体细胞连续核移植是可行的。     

哺乳类动物胚胎干细胞多能性和全能性研究进展

交ＥＳ细胞分离与克隆技术和分子生物学技术相结合就可将新的遗传物质导入家畜的生殖腺细胞。通过囊胚注入胚胎干细胞产生嵌合体小鼠表明对胚胎干细胞进行遗传操作是对物生殖细胞进行遗传改造的有效方法之一。     

牛繁殖技术的新进展

动物繁殖技术是生物技术的重要分支。繁殖技术从20世纪50年代人工授精技术到20世纪70年代胚胎移植技术的应用,似乎才真正开始动物繁殖技术的新纪元。牛的繁殖技术在过去的50年里取得了显著进展,这是一个以人工授精起始的连续过程。随着体外受精、精子分离和核移植（克隆）等技术的发展,这些连续性的繁殖技术将是目前和未来提高生产力的强有力手段。     

提高兔核移植胚胎体外发育率的研究

 本研究首先比较了不同培养液维持兔胚体外发育的作用，以及多种卵母细胞去核显微操作的去核效率，建立了高效的体外培养体系及去核方法。然后对16-细胞期卵裂球的细胞周期及核移植（Nuclear transplantation,NT）胚的核质比对发育的影响进行了试验，结果表明：G#-1期NT胚的发育率优于G#-2期NT胚（P<0.01）。当G#-1期NT胚的核质比等于卵母细胞时，78.5%(73/93)可在兔眼球玻璃体液(Rabbit vitreous humor,RVH)中发育至囊胚期。这是迄今为止，在动物胚细胞核移植试验中所获得的最高发育率。     

用超低温保存的囊胚细胞进行核移植试验

对超低温冷冻保存囊胚细胞的方法、保护剂的选用以及核移植的效果进行了初步研究.利用超低温冷冻保存的囊胚细胞进行核移植是解决核移植中供体与受体时间配合的一种有效方法。     

体细胞核移植技术生产转入溶菌酶基因(hLYZ)牛胚胎的研究

本研究主要探讨经基因修饰和筛选后转基因供体细胞的挑选及处理对牛转入溶菌酶基因克隆胚胎早期发育的影响.用含人溶菌酶基因(human lysozyme,hLYZ)乳腺特异表达载体pEBH重组质粒转染高产荷斯坦牛成纤维细胞,经G418筛选后的转基因阳性细胞作为核供体细胞成功构建了转hLYZ基因克隆胚胎.结果发现,基因转染及筛选过程对转基因重构胚的发育有不利的影响,囊胚发育率显著降低;以注核针内径为参照,挑选直径为15～20μm的转基因阳性细胞作为供体细胞,重构胚的融合率和囊胚率较其它组差异显著(分别为80.4%和33.8%,P<0.05);生长旺盛期的细胞构建的转基因克隆胚的卵裂率及囊胚发育率显著高于经血清饥饿和生长接触抑制处理组(P＜0.05);所有的转基因克隆胚在体外发育的各个发育时期都能观察到绿色荧光蛋白的表达,但表达的强弱在不同个体及相同个体不同发育时期之间存在差异.随机挑选10枚囊胚以PCR法进行鉴定,结果全部为阳性转基因胚胎.研究结果表明,利用体细胞核移植方法可以获得转舰hLYZ基因的克隆胚胎,重构胚可成功的发育到囊胚阶段;挑选生长旺盛期的直径为15～20 μm的转基因阳性细胞作为供体细胞可显著提高转基因克隆胚的融合率和囊胚率.     

牛细胞核移植研究简报

本研究探讨了用体外受精胚胎作供体、体外成熟卵母细胞作受体进行核移植的可能性，比较了两种不同核移植方法的效果。本研究结果在我国首次获得牛核移植的成功。从屠宰场回收的黄牛卵巢中抽取未成熟的卵母细胞，采用以前报道的方法（Ｓｈｉｅｔａｌ，Ｔｈｅｎ－ｏｙｅｎｏｌｏｙ，１９９１，３５；２７１）进行体外成熟（ＩＶＭ）和体外受精（ＩＶＦ），获得ＩＶＭ如母细胞和ＩＶＦ胚胎。体外受精用精液为奶牛精液。在ＩＶＭ２３～２４ｈ＄母细胞去核后用作受体卵，体外发育到８～３２细胞期的ＩＶＦ胚胎用作核供体．去核后的卵母细胞分两组：！．在Ｗ２６ｈ（或３０ｈ）用８０Ｖ／ｍｍ４０μｓ电激活两次，然后注入供体胚胎卵裂球，ＩＶＭ３２ｈ（或３６ｈ）进行电融合；Ⅱ．注卵裂球前不激活，在ＩＶＭ３１ｈ进行电融合。两组融合条件相同（８０Ｖ／ｍｍ４０μｓ×２，间隔１ｓ），融合液为０．３Ｍ甘露醇＋０．０５ｍＭＣａＣｌ２＋０．１ｍＭＭｇＳＯ４＋１０ｍＭ组氨酸。融合印在颗粒细胞单层培养滴内共培养，体外培养２４ｈ后观察卵裂结果。经体外培养５～８ｄ后发育到桑椹和囊胚的核移植胚胎移植到同期发情的受体奶牛子直角内。２个月后直检妊娠情况。本研究结果如下：Ⅰ组操作后存活率（９０．     

山羊-绵羊种间体细胞核移植重构胚构建

以山羊皮肤成纤维细胞为供体细胞,绵羊去核卵母细胞为受体细胞进行种间体细胞核移植,构建山羊-绵羊重构胚,并对其采用离子霉素联合6-DM AP法和胞质注射绵羊精子提取物法进行激活,比较两种不同激活方法对山羊-绵羊种间体细胞核移植重构胚的激活效果。结果表明,共构建获得山羊-绵羊重构胚238枚,重构胚在体外能够发育至囊胚阶段;离子霉素联合6-DM AP法激活的卵裂率为58.33%(70/120),囊胚发育率为4.28%(3/70);胞质注射绵羊精子提取物法激活的卵裂率为63.55%(75/118),囊胚发育率为6.66%(5/75),两种方法的激活效果差异不显著。     

CCB、蔗糖及成熟时间对山羊卵母细胞去核效果的影响

分离培养山羊卵母细胞,采用盲吸法去核,研究不同成熟培养时间(18,22和26 h)不同细胞松弛素B(CCB)浓度(5,7.5,10,15 mg/L)和不同蔗糖浓度(20,25,30 g/L)对卵母细胞去核效果的影响。结果表明,山羊卵母细胞最佳去核条件为:卵母细胞体外成熟时间为22 h,去核时操作液中CCB质量浓度为7.5 mg/L,蔗糖质量浓度为20 g/L。