动物体细胞克隆研究进展

1997年 2月 ,Ｗｉｌｍｕｔ等在《Ｎａｔｕｒｅ》上发表了轰动世界的论文“Ｖｉｂｌｅｏｆｆｓｐｒｉｎｇｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｆｅ ｔａｌａｎｄａｄｕｌｔｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓ” ,在他们的实验中诞生了体细胞克隆绵羊“多莉”[1 ] 。多莉的诞生 ,标志着复制动物从幻想变成现实。继之克隆小鼠和克隆牛的相继问世 ,表明体细胞克隆是完全可以实现的。动物体细胞克隆是一种无性繁殖方式 ,即将成年动物体细胞 (核供体 )与去核的卵母细胞(核受体 )融合 ,重新构建胚胎 ,这样不经过有性繁殖过程连续不断地复制遗传上相同的胚胎 ,并通过…     

牛乳腺干细胞核移植

近些年来,体细胞核移植虽然取得了很大的进步,但核移植效率仍然很低,而供核细胞的选择对于核移植效率起着关键的作用.本研究针对牛乳腺干细胞(mammary stem cells,MSCs)和牛乳腺上皮细胞(mammary epithelial cells,MECs)作为核移植的供核细胞,比较了重构胚发育率和核移植胚胎干细胞分离率的差异,发现来源于MSCs的重构胚的卵裂率为69%(331/479),囊胚发育率为27%(130/479);来源于MECs的卵裂率为71%,囊胚发育率为17%(84/495).囊胚发育率差异显著(p＜0.05).试验从176个核移植重构囊胚分离培养胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES cells),发现来源于MSCs的重构胚的NTES贴壁率为44%(39/88),来源于MECs的NTES贴壁率为28%(25/88),NTEs的贴壁率差异显著(p＜0.05).以上数据表明,来源于MSCs的重构胚具有较高的发育潜能.     

哺乳动物异种体细胞核移植技术的应用及影响因素

哺乳动物异种体细胞核移植技术是在同种细胞核移植技术基础上发展起来的动物生殖技术,其在濒危动物保护、人类胚胎干细胞及生物基础学科研究等方面已展现出美好的前景.目前,该技术处于发展阶段,还存在很多值得研究的问题.文章介绍了动物异种体细胞核移植技术在国内外的研究现状,分析了影响异种体细胞核移植技术发展的因素,并对该技术的发展前景进行了展望.     

猪胚胎细胞核移植

选用杜洛克２～１６细胞期胚胎卵裂球作核供体，湖北白猪卵母细胞作核受体，通过显微操作和电融合法构成重组胚。体外培养时，以融合前２ｈ，１ｈ激活及融合前不激活的卵母细胞做核受体的重组胚，发育率分别为６４．６％（３１／４８），５５．３％（２６／４７）和３４．５％（１９／５５）。６１枚重组胚移入同步发情的５头受体母猪输卵管，１头于妊娠１１７ｄ产下５头核移植仔猪。结果表明，激活卵母细胞作核受体优于未激活卵母细胞。成熟卵母细胞的胞质对于移入的核具有重排能力     

整合人乳铁蛋白cDNA山羊胎儿成纤维细胞系的建立

通过转基因动物乳腺表达系统生产重组药用蛋白比微生物发酵系统和动物细胞培养系统具有很多优势;同时,体细胞核移植技术为制备动物乳腺生物反应器开辟了一条新的途径。本实验旨在建立稳定整合人乳铁蛋白cDNA的山羊胎儿成纤维细胞系,为体细胞核移植法制备转基因动物提供可靠的供体细胞。本研究采用RT-PCR获得人乳铁蛋白cDNA,通过Long and Acute PCR扩增山羊β-酪蛋白5’ 端6.5 kb的调控序列,以pEGFP-C1为骨架构建乳腺特异性表达载体 p6.5hLF-EGFP。脂质体介导法转染山羊胎儿成纤维细胞,G418抗性筛选3-4周后,经PCR扩增和报告基因EGFP表达检测,得到稳定整合外源基因的转基因供体细胞系,为制备高效表达人乳铁蛋白的转基因山羊乳腺生物反应器提高可靠的核移植供体细胞。     

蛋白酶抑制剂MG-132对牛核移植重构胚重编程的影响

旨在探讨MG-132对牛体细胞核移植重构胚重编程的影响。将牛卵母细胞体外培养至MI期,添加不同浓度的MG-132(0、3、5、7、10μmol·mL-1),至成熟后进行激活,通过胚胎的发育情况得出MG-132的合适浓度,并用此浓度的MG-132作用于核移植全过程,来研究MG-132的作用,用免疫组化的方法进一步验证结果。结果,5、7μmol·mL-1MG-132组卵裂率和囊胚率均显著低于对照组和2μmol·mL-1组(P0.05),但这2组间无显著差异(P0.05),而10μmol·mL-1组卵裂率只有23.44%,低于其他各组(P0.05);成熟卵母细胞在5μmol·mL-1MG-132中分别作用0、2、4h激活后,卵裂率、囊胚率均无显著差异(P0.05),而6h组激活后卵裂率、囊胚率均明显降低(P0.05);核移植操作过程中添加MG-132组的卵裂率与对照组相比无显著差异(P0.05),而桑葚胚和囊胚率都较对照组显著升高(P0.05);未添加MG-132组,融合后1h供体细胞几乎无变化,4h后核纤层蛋白(lamin)着色显著,说明染色体凝集不完全;添加组融合4h后,核膜不完全着色,明显发生了染色体凝集。上述结果说明5μmol·mL-1MG-132能够促进重构胚的重编程,但对重构胚移植后的附植和妊娠作用还有待进一步研究。     

生物技术在植物育种上的新应用

生物技术又称生物工程,是生物科学与技术科学相结合的产物.它是综合利用遗传学、生物化学、微生物学和生化工程理论、基因剪裁重组、细胞融合、核移植技术来改造生物,创造新物种的技术总称.传统生物技术包括发酵工程、细胞工程、酶工程和遗传育种等几大领域.目前,生物技术已发展到以基因工程、克隆技术和生物信息学为核心的现代生物技术时代.     

陕北白绒山羊种公羊的体细胞克隆

【目的】利用体细胞核移植技术克隆陕北白绒山羊优秀种公羊个体。【方法】以特别优秀成年陕北白绒山羊种公羊耳部皮肤成纤维细胞为供体细胞,体外培养成熟的陕北白绒山羊卵母细胞作为受体,利用显微操作方法对成熟卵母细胞进行去核操作,然后将供体细胞注射到其卵周隙内,经电融合将其导入去核卵母细胞内形成核移植重组胚。利用钙离子载体Ionomycine联合蛋白酶抑制剂6甲基氨基嘌呤（6-DMAP）对核移植重组胚进行激活处理,挑选激活后完整的胚胎继续进行体外培养,然后在2～16细胞期时将克隆胚胎移植到相应的同期发情受体母羊体内,利用PCRRFLP技术鉴定克隆羊。【结果】构建了体细胞核移植胚胎253枚,重组胚胎的融合率为71.54%(181/253),体外培养后的卵裂率为68.33%（123/180）,囊胚发育率为25.20%（31/123）;在此基础上,构建了537枚克隆胚,将其中卵裂的359枚分别移植到32只代孕母羊体内,移植60 d后,有2只受体母羊确认妊娠,最终1只受体母羊妊娠第4月流产出2只死羔;另1只受体母羊维持到期并顺产体细胞克隆羊1只。经遗传学鉴定,2只流产羊羔与1只存活个体均为体细胞核移植后代。【结论】获得陕北白绒山羊克隆个体,建立了相对完善的陕北白绒山羊克隆技术体系。     

供体细胞来源和TSA处理对牦牛iSCNT胚胎重编程的影响

【目的】探讨不同来源的供体细胞和TSA处理对牦牛异种体细胞核移植(Interspecies nuclear transfer,iSCNT)胚胎的影响。【方法】以黄牛卵母细胞为受体,分别以牦牛50日龄胎儿及6和18月龄个体成纤维细胞为供体,构建牦牛iSCNT胚胎,研究供体细胞来源对牦牛iSCNT胚胎的影响。分别用0(对照),20,40,60和80 nmol/L的TSA处理50日龄胎儿成纤维细胞12 h,构建iSCNT胚胎,比较其发育情况,确定TSA的最佳处理浓度;用最佳浓度的TSA处理50日龄胎儿成纤维细胞0(对照),6,12和18 h,构建iSCNT胚胎,比较其发育情况,确定TSA的最佳处理时间。用最佳TSA作用时间和浓度处理供体细胞,构建牦牛iSCNT,之后用40和80 nmol/L的TSA分别处理iSCNT胚胎6 和12 h,比较不同处理方式对牦牛iSCNT胚胎发育的影响。采用qRT-PCR方法检测40 nmol/L TSA处理供体细胞6 h 的iSCNT胚胎及40 nmol/L TSA处理供体细胞6 h且处理iSCNT胚胎12 h的iSCNT胚胎去乙酰化酶2(HDAC2)基因mRNA的表达水平,以不进行TSA处理的iSCNT胚胎为对照。【结果】以50日龄胎儿成纤维细胞作为供体细胞,牦牛iSCNT胚胎的囊胚率最高,但与其他组差异不显著(P＞0.05)。40 nmol/L TSA处理供体细胞6 h能显著提高牦牛iSCNT胚胎的囊胚率(30.6%),且与对照组差异显著(P＜0.05)。用40 nmol/L TSA处理牦牛iSCNT胚胎12 h组的囊胚率高于80 nmol/L TSA处理iSCNT胚胎6 h组,2组间差异不显著(P＞0.05)。用TSA处理供体细胞和iSCNT胚胎之后,HDAC2 mRNA表达水平降低,且与对照组差异显著(P＜0.05)。【结论】不同来源的供体细胞对iSCNT胚胎发育的影响不明显;40 nmol/L TSA处理供体细胞6 h和iSCNT胚胎12 h能显著提高牦牛iSCNT胚胎体外发育及重编程能力。     

日本克隆牛技术的研究进展

本文通过考察日本从事新生殖生物技术的研究单位，并参阅有关试验研究的资料，着重介绍了日本近几年来克隆牛技术的研究现状与发展趋势，并对胚胎细胞和体细胞的克隆牛技术、存在问题和今后研究的方面等作了阐述。