利用冷冻的GV期卵母细胞制备延边黄牛核移植胚胎的研究

研究使用玻璃化冷冻、程序化冷冻和超快速冷冻3种方法冷冻延边黄牛的卵母细胞,确定适宜的延边黄牛核移植受体卵母细胞的冷冻方法。结果显示,3种冷冻方法处理的GV期卵母细胞在成熟率上相似,玻璃化冷冻法得到的卵母细胞形态正常率要高于程序化冷冻和超快速冷冻法(P<0.05),超快速冷冻法回收率最低。采用玻璃化冷冻法,核移植重组胚卵裂率明显高于程序化冷冻和超快速冷冻法(P<0.05),在融合率上,3种方法差异不显著。表明玻璃化冷冻方法对延边黄牛GV期卵母细胞冷冻效果优于程序化冷冻和超快速冷冻方法,是一种较适合延边黄牛核移植的卵母细胞冷冻方法。     

利用体细胞核移植技术生产表达红色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎（摘要）

[目的]为生产转基因克隆猪奠定基础。[方法]以反转录病毒转染的带有红色荧光蛋白（RFP）基因的猪胎儿成纤维细胞作为核移植的核供体,利用体细胞克隆技术研究红色荧光蛋白克隆胚胎体外发育情况。[结果]RFP转基因细胞的融合率为83.87%,与未转基因细胸（80.56%）相比无显差异著（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚体外囊胚率为8.67%,与未转基因细胞组（6.56%）相比无显差异著（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚移植于15头受体后,尚无受孕个体。[结论]利用转红色荧光蛋白基因的细胞为供体细胞,并成功地克隆出转基因胚胎。     

食蟹猴——猪异种体细胞核移植胚胎的构建

[目的]探索食蟹猴—猪异种核移植胚胎的发育能力,为食蟹猴异种核移植胚胎干细胞的构建奠定基础.[方法]以食蟹猴和猪胎儿的耳部成纤维细胞为供体,猪MⅡ期去核卵母细胞为受体,构建异种核移植重构胚,并从核移植融合/激活方式、培养液两个方面进行优化.[结果]70枚食蟹猴—猪异种核移植胚胎中,有49枚分裂(70.0%),与猪同种核移植胚胎的分裂率(76.6%)无显著差异;使用微卫星引物D15S823对食蟹猴—猪异种核移植胚胎进行遗传学鉴定,均能扩增获得D15S823条带(350 bp);食蟹猴—猪异种核移植胚胎融合后1h的染色体早熟凝集率(24.2%)显著低于猪同种核移植胚胎(44.7%)和猪孤雌激活胚胎(100.0%),通过使用无Ca2+融合液能够显著提高染色体早熟凝集率(48.2%);在PZM-3、HECM-10和HECM-10+10% FBS 3种培养液中,食蟹猴—猪异种核移植胚胎的分裂率无显著差异.[结论]食蟹猴体细胞核能够在猪MⅡ期去核卵母细胞胞质中发生核重塑,并发育到8-细胞阶段.     

山羊核移植胚胎干细胞的分离培养

比较了不同发育阶段山羊核移植胚胎分离培养胚胎干细胞（NT-ESCs）的情况。结果表明,各阶段山羊核移植胚胎均可分离出NT-ESCs,其中孵化胚的NT-ESCs克隆形成率最高（38%）,与囊胚（26%）差异显著,与桑葚胚（18%）差异极显著。所分离的NT-ESCs细胞形态与正常ESCs相似,均具有碱性磷酸酶活性,可表达多能性基因Oct-4和表面标志抗原SSEA-1。     

利用体细胞核移植技术生产表达红色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎研究

[目的]为生产转基因克隆猪奠定基础。[方法]以反转录病毒转染的带有红色荧光蛋白（RFP）基因的猪胎儿成纤维细胞作为核移植的核供体,利用体细胞克隆技术研究红色荧光蛋白克隆胚胎体外发育情况。[结果]RFP转基因细胞的融合率为83.87%,与未转基因细胞（80.56%）相比无显著差异（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚体外囊胚率为8.67%,与未转基因细胞组（6.56%）相比无显差异著（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚移植于15头受体后,尚无受孕个体。[结论]利用转红色荧光蛋白基因的细胞为供体细胞,能够成功克隆出转基因胚胎,并获得转基因囊胚。     

猪卵母细胞体外成熟的发育潜力及核移植重构胚构建方法的研究

为了提高猪体细胞核移植重构胚发育潜力,本研究对体外成熟28h、32h、36h、40h、44h、48h、52h和56h的猪卵母细胞分别进行去核构建重构胚。研究结果表明,成熟44h的卵母细胞核移植后有较高的融合率（58.99%）、卵裂率（67.52%）和囊胚率（22.78%）,而成熟48h的卵母细胞则分别为56.51%、65.73%和15.96%;且卵龄为44h的卵母细胞核移植后分裂率与囊胚率显著高于卵龄为40h、36h、32h、28h的卵母细胞的分裂率与囊胚率（P〈0.05）。卵龄为48h的卵母细胞融合率高于卵龄为52h卵母细胞的融合率（P〈0.05）。同时我们还探讨了不同去核方法（盲吸法、Hochest33342染色法和Spindle-view system）对猪体细胞核移植重构胚发育能力的影响。研究结果发现,盲吸法、Hoechest33342染色法和Spindle-view system法的去核率分别达到76.33%,100.00%和98.40%。Hoechest染色法去核率显著高于盲吸法的去核率（P〉0.05）,而与Spindle-view法去核率没有差异（P〉0.05）。三种方法在融合率和囊胚率方面差异不显著（P〉0.05）,但Hoechest染色法的分裂率较低,差异显著（P〈0.05）。进一步的研究表明,细胞质内注射进行核移植构建重构胚的分裂率和囊胚率分别为68.13%和6.44%;透明带下注射法则为60.37%和8.08%,两者差异不显著（P〈0.05）;两者均可运用于猪体细胞的核移植,这为建立有效的猪体细胞核移植体系提供了参考。     

核移植技术在建立乳腺生物反应器中的应用

乳腺生物反应器的开发为制药业带来了生机,但目前采用的动物基因转移的方法,由于其各自固有的局限性,未能使得乳腺生物反应器的研究取得长足的进步。而核移植技术的发展为乳腺生物反应器的开发注入了活力。因此,笔者综合近年来国内外的文献,提出了核移植中供体细胞的选择以及处理方法,同时也从分子水平阐述了乳腺的一些调控机制,为核移植技术在乳腺生物反应器中的应用奠定了基础。     

挤压去核法和盲吸去核法在延边黄牛体细胞核移植中的对比研究

分别采用挤压去核法和盲吸去核法对延边黄牛卵母细胞进行去核处理,之后进行核移植,培养观察,比较两种去核方法对延边黄牛体细胞核移植效率的影响.挤压法的操作成功率和去核率明显高于盲吸法,盲吸法操作程序耗时比挤压法长,但是差异不显著.两种方法获得了相近的卵裂率和囊胚率,但挤压法构建的重组胚在囊胚数上高于盲吸法.挤压法在延边黄牛体细胞核移植上比盲吸法更有效.     

改进的末期去核方法解决延边黄牛卵母细胞第一极体残留问题

传统的末期去核方法仅仅去掉了第二极体及其附近少量的细胞质,第一极体仍然残留在卵母细胞中.本研究中,将末期去核方法进行了改进,即在去除第二极体及其附近少量胞质的同时去除第一极体.采用改进的末期去核法和传统的末期去核方法对延边黄牛卵母细胞进行去核操作,比较两种方法的去核率以及重组胚后期发育的整体效率.改进的末期去核法在去核率[(90.51±3.05)%]以及囊胚形成率[(8.78±2.38)%]上与传统的方法[分别为(87.00±1.82)%、(6.56±2.95)%]相似;传统的末期去核法在去核操作上耗时较长[(44.13±2.60)s],但在注核操作上用时略短于改进的末期去核法[(30.33±1.17)s];改进的末期去核方法所构建的重组胚异常发育率比传统的末期去核法低[(18.02±2.83)%],但差异不显著.改进的末期去核方法,去除第一、第二极体及其附近少量细胞质,可达到较高的去核率,并且支持发育到囊胚,同时解决了第一极体残留的问题.     

浅谈我国奶牛业的发展途径

我国奶牛业在经历了3个发展阶段以后，至2003年存栏数和总产奶量均达到历史最高水平，且发展势头强劲。但按“两高一优”标准衡量，吸取国际奶牛业发展经验，作者建议要控制头数，提高单产，增加总产量，以节约粮食资源。为实现此目标，建议从生产群、育种群和顶尖群3个不同层面上分别进行性控体外胚移、性控体内胚移和体细胞核克隆，并配合相关技术，以期全面提高我国牛奶产量。