哺乳动物细胞核移植研究进展

哺乳动物细胞核移植(Nuclear transfer,NT)是目前生物技术领域研究的热点之一,其科学意义和应用价值重大。本文根据近年来国内外的研究进展,对核移植技术研究概况、目前存在的问题和应用前景作一综述,希望能够对从事核移植研究的同行有所帮助。     

兰州大尾羊重复超数排卵效果分析

正冷冻胚胎保存动物遗传资源与其他保存技术相比具有突出的优越性,胚胎保存了品种的全部基因,若有数量充足的胚胎,可保存与现有物种遗传多样性一致的遗传资源。细胞可以在超低温条件下长期保存,即使活物消失,只要存在同种物种,通过胚胎移植和核移植技术就可恢复这些遗传资源。因此,在保护动物遗传资源,尤其是挽救     

RG108对猪胎儿成纤维细胞甲基化水平及克隆胚胎发育的影响

本研究使用RG108处理猪胎儿成纤维细胞(Porcine fetal fibroblast,PFF),研究其对细胞甲基化水平和核移植效率的影响。使用0.05、0.5、5和50μmol·L-1RG108分别处理细胞24、48和72 h后,用高效液相色谱和亚硫酸氢盐测序(Bisulfite sequencing PCR,BSP)法分析细胞整体甲基化水平和印迹基因H19和IGF2R的DMR区甲基化率,并检测RG108处理对细胞生长、凋亡、染色体变化及随后的核移植效率的影响。整体甲基化水平结果通过两因素方差分析,发现RG108处理浓度与处理时间无交互作用,处理浓度间细胞甲基化水平差异不显著,但处理时间却能显著的影响甲基化水平,且50μmol·L-1RG108处理细胞72 h后整体甲基化水平显著低于对照组。BSP分析结果表明,5和50μmol·L-1处理PFF 72 h后H19的DMR区域甲基化率显著降低。RG108对细胞生长有一定的抑制作用,且0.5、5和50μmol·L-1组经处理72 h后凋亡比例显著提高,但对细胞的染色体数目没有显著影响。PFF经5和50μmol·L-1RG108处理72 h后能显著提高卵裂率和囊胚细胞数,且5μmol·L-1组囊胚率也显著提高。结果表明,RG108降低细胞整体甲基化水平呈时间依赖性,且同时降低H19的DMR区域甲基化率。PFF经5μmol·L-1浓度处理72 h组能显著提高核移植胚胎效率。     

受体卵母细胞来源和供体细胞类型对山羊体细胞核移植融合率的影响

以波尔山羊体细胞作为核供体进行核移植,比较受体卵母细胞来源以及不同供体细胞类型对核移植重构胚融合率的影响。结果:以体内成熟和FSH处理卵巢、屠宰场卵巢来源的体外成熟卵母细胞做核移植受体卵母细胞,重组卵的融合率分别为71.9%,78.4%,73.1%,三者之间差异不显著;以卵丘细胞和皮肤成纤维细胞做核供体,重组卵的融合率分别为77.1%,68.3%,二者之间差异显著。     

核移植兔研究进展

哺乳动物胚胎细胞核移植(NuclearTransplantation,NT)是指将动物早期胚胎卵裂球以显微手术和细胞融合的方法移植入去核的卵母细胞,并使其能正常分裂、发育成为新个体的技术。核移植技术对于研究动物繁殖和胚胎在发育过程中的核质互作有重要意义。尽管核移植在多种动物都已...     

牛兔异种体细胞以兔卵母细胞为核受体的牛体细胞克隆研究

随着同种动物克隆后代的不断降生,人们又开始尝试异种动物体细胞核移植。用兔的卵母细胞作为核受体进行牛的体细胞核移植,研究表明,颗粒细胞作为供核体与兔去核卵母细胞的融合率(60.5%,57.9%)稍高于皮肤成纤维细胞的融合率(52.2%,48.4%),但两者间差异并不显著。颗粒细胞与皮肤成纤维细胞均采用饥饿培养和接触抑制培养两种不同的方式进行诱导处理,融合卵在电激活后能够卵裂并发育的情况差异显著(72.6%对51.4%;70.4%对52.2%)。有少数重构胚发育至囊胚,证明在哺乳动物异种重构胚早期发育中,异种细胞核与细胞质间是相容的。     

不同受体胞质对牛体细胞核移植效果的影响

通过研究不同受体胞质对核移植效果的影响,结果发现:部分体外成熟16~18 h的牛卵母细胞,其细胞核已完成成熟,胞质可直接用于核移植而不需进行激活处理,直接进行核移植囊胚率达7.7%;体外成熟培养(IVM)30 h的TⅡ期受体胞质较IVM 20~22 h激活的TⅡ期胞质核移植效果差,不适宜作受体胞质;MⅡ期胞质核移植效果优于TⅡ期胞质,两组囊胚率分别为11.7%和5.2%(P<0.05)。     

动物转基因与核移植技术的新进展

本文就动物转基因与核移植技术进行文献回顾，原核注射是一种可靠、使用广泛的动物转基因方法，但该方法存在花费时间长、整合效率低及不能定点整合的问题。所以近年来出现了一些新的转基因方法，包括精子介导、反转录病毒介导、携带外源基因体细胞的核移植、ES细胞基因打靶技术等。这些方法中动物核移植技术贡献较大，很有前途。核移植技术解决了同源重组在大动物上的限制，可以应用于生物制药动物保种、预防遗传病、辅助生殖及治疗性克隆。     

转基因猪在农业和生物医学中的应用

早期方法制备转基因猪仅局限于外源基因的随机整合。胎儿体细胞同源重组技术与核移植技术相结合，使猪的基因组定位修饰成为可能。在人猪器官移植研究中，对引起超急排斥反应(HAR)基因进行敲除，首次实现了猪基因组的定位修饰。因为猪被广泛用作人类疾病模型，所以基因修饰为改变这些模型或创建更多模型提供了较好的途径。然而棱移植动物易出现表型异常。表型异常可能是外源基因改变而未被正常转入所致。虽然利用棱移植基因定位修饰技术已成功制备出转基因动物，但棱移植技术、体细胞培养条件及基因修饰技术尚待进一步完善。     

Studies on Nuclear Transplantation in Mammalian Embryos

A series of experiments were conducted to study the major procedures in nuclear transplanation such as oocyte enucleation and activation,electrofusion and developent of the nuclear transplant embryos in the mouse,rabbits and sheep.The important results are as follows:1.In the mouse,only 35% of the oocytes collected 15-16h after hCG had a notable first polar body(FPb) and those without FPb were enucleated by removing cytoplasm from the PVS-wider side and the enucleation rate was similar to that in the oocytes with FPb,and the enucleation rate of removing 1/3 cytoplasm was remarkably higher than that of removing 1/4 cytoplasm.2.Among the three fusion media tested;mannitol and sucrose solutions produced better results than M2 in electrofusion of mouse 2-cell embryos.Under favorable pulse conditions,the osmotic pressure of fusion medium had no motable effect on electrofusion,but as the conditions became so unfavorable that some embryos began to lyse,the fusion rates in hypertonic mannitol solution were significantly higher than those in isotonic or hypotonic solutions.A wide range of pulse strengths (0.31-2.04kv/cm) and durations(10-1280us) were used and 100% of fusion were obtained in many cases.Optimal pulse durations were plotted for field strengths to obtain high fusion rates(96%-100%)in mouse2-cell embryos.3.With one pulse of 0.45kv/cm,satisfactory results of mouse oocyte activation were obatined only when the duration increased to 160us or longer,The activation rate increased as the oocytes got older.Some of the oocytes ar.rested at metaphaseⅢ after electrical stimulation and their proportion to the number of oocytes not activated increased with egg age.4.10% and 31% of the nuclear transplant embryos developed to morula or blastocyst stage in sheep and rabbits,respectively,with Chinese-made hormones and chemicals.