核酸适体检测赭曲霉毒素A荧光方法的建立

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)普遍存在于谷物等粮食和动物饲料中,是一种可以引起癌症的霉菌毒素。为了快速检测OTA,利用荧光染料PicoGreen识别双链DNA原理,建立了一种基于核酸适体与PicoGreen检测毒素OTA的方法。在10 mmol/L Tris,120 mmol/L Na Cl,5 mmol/L KCl,20 mmol/L CaCl2(pH8.5)缓冲液中,PicoGreen与双链DNA结合后,释放的荧光在3 min内达到峰值(激发波长为480 nm,发射波长为520 nm)。从加样到荧光检测,整个流程可在40 min内完成。检测OTA的灵敏度为1μg/L;检测范围为1μg/L~200μg/L。特异性实验表明:OTA核酸适体-Pico Green方法与黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、桔毒素和玉米赤霉烯酮等霉菌毒素无交叉反应。本方法在检测敏感性和特异性方面与传统抗体ELISA方法相当(Kappa值为:0.857)。由于核酸适体成本比抗体低,因此本方法比抗体ELISA方法更具实用价值。     

小麦面粉中赭曲霉毒素A的CdSe/ZnS荧光量子点免疫探针检测

构建一种基于荧光量子点免疫探针的小麦面粉中赭曲霉毒素A(OTA)的检测方法。以EDC为活化剂将CdSe/ZnS半导体荧光量子点与OTA单克隆抗体偶联,制备OTA检测探针并评价其检测性能。结果表明:制备的检测探针在3d保存期内具有良好的稳定性。当OTA质量浓度为0.1~0.9μg/L时,检测探针的荧光强度与OTA质量浓度呈线性关系,其相关系数为0.996 3,检出限为0.017 7μg/L。与国标法对照的结果说明,此方法具有可行性。小麦面粉中的加标回收试验结果显示,OTA的回收率为96.0%~102.7%,相对标准偏差不超过4.1%,说明准确性良好。可见,OTA的CdSe/ZnS荧光量子点免疫探针检测方法操作简单、准确度高、结果稳定,有望应用于小麦面粉中OTA的检测。     

高产红曲色素低产桔霉素紫色红曲霉转化子筛选与代谢产物分析

以红曲米中筛选到的紫色红曲霉Mp-41菌株为出发菌株,利用农杆菌介导T-DNA插入转化技术,构建了含有983株红曲霉转化子的T-DNA插入转化子库。用紫外-可见光扫描方法等从转化子库中筛选出10株红曲色素色价稳定高于原始Mp-41菌株的转化子,薄层层析结合高效液相色谱(HPLC)技术分析了10株转化子发酵液中桔霉素的含量;其中,转化子62的红曲色素色价较高,为95.4 U/m L,是原始Mp-41菌株(色素色价50.7 U/m L)的1.88倍,桔霉素含量稳定低于原始Mp-41菌株。以原始Mp-41菌株和转化子62为试验材料,进行5 L发酵罐发酵并定时取样,HPLC等方法分析生长量和发酵液中各种代谢产物的含量。结果显示,转化子62生长速度稍快于原始Mp-41菌株,红曲色素色价和莫纳可林K的含量分别为120.76 U/m L,63.72 mg/L,是原始Mp-41菌株的1.5倍和1.21倍;而桔霉素含量为1.172 4 mg/L,是原始Mp-41菌株的35.08%。因此,利用T-DNA插入的方法对红曲霉进行育种,能产生稳定的遗传变化,在红曲霉资源的利用上有一定潜力。     

利用果胶降解菌塔宾曲霉GYC 501改善梗丝品质及其发酵条件的优化

烟草梗丝中含有大量果胶、纤维素等细胞壁物质,造成吸味不好,对其在烟制品中的应用造成了阻碍。本研究旨在利用GYC 501的发酵酶液处理烟草梗丝,以降解其中以果胶为主的多糖,改善吸味。本研究首先建立了一种测定烟草梗丝中果胶含量相对简易的方法,并从发酵时间、缓冲液浓度、缓冲液p H值、发酵温度、酶的使用量入手,先进行单因素优化实验再进行正交实验,以优化发酵条件。结果显示:使用塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)GYC 501在烟草梗丝培养基中发酵48 h后所得到的发酵液对烟草梗丝进行发酵处理,得到最优发酵条件:酶使用量为1536 U,发酵时间为12h,温度为42℃,缓冲液p H为4.8,缓冲液浓度为0.3 mol/L,梗丝含水量为50%。在此最优发酵条件下,梗丝果胶降解率最佳,为34.97%。     

茶叶微生物固态发酵中咖啡碱降解途径初探

为探究微生物作用下咖啡碱的降解产物与途径,将普洱茶发酵中筛选鉴定的Aspergillus sydowii NRRL250（聚多曲霉）、Aspergillus pallidofulvus NRRL4789、Aspergillus sesamicola CBS137324和Penicillium mangini CBS253.31等优势菌株分别接种至晒青毛茶进行单菌种固态发酵,并采用高效液相色谱（HPLC）测定咖啡碱、可可碱、茶碱的含量,探究微生物对咖啡碱代谢的影响;另外,基于UHPLC-QTOF-MS代谢组学技术,以灭菌处理组（ST组）和原料组（RM组）为对照,对聚多曲霉接种发酵样进行代谢组学分析。结果表明,A. pallidofulvus NRRL4789、A. sesamicola CBS137324和Penicillium mangini CBS253.31等优势菌株对咖啡碱等嘌呤类碱代谢均无显著影响,而在聚多曲霉接种发酵中,咖啡碱含量显著下降（P<0.05）,降幅达83.89%;茶碱含量显著增加（P<0.05）,发酵末期含量为(25.03±1.17) mg·g^-1;而可可碱保持基本稳定。由此可知,聚多曲霉对咖啡碱降解代谢有显著影响。采用UHPLC-QTOF-MS方法检出茶碱、3-甲基黄嘌呤、1,7-二甲基黄嘌呤等9种与咖啡碱降解相关的代谢物。在聚多曲霉作用下,茶碱、3-甲基黄嘌呤、1,7-二甲基黄嘌呤、7-甲基黄嘌呤含量显著提高（P<0.05）。茶碱、3-甲基黄嘌呤、1,7-二甲基黄嘌呤和1-甲基黄嘌呤与咖啡碱及其相关代谢物的N-脱甲基化途径相关。1,7-二甲基尿酸、1-甲基尿酸与咖啡碱相关代谢物的氧化途径相关。由此可知,聚多曲霉为降解普洱茶咖啡碱的优势菌株,且具有将咖啡碱转化为茶碱的潜在能力;在咖啡碱降解代谢过程中,存在聚多曲霉作用下的N-脱甲基化和氧化,并以N-脱甲基化为主。     

黄柄曲霉ASD次生代谢产物的鉴定及抑菌活性

为明确土壤来源的黄柄曲霉ASD次生代谢产物中的抑菌物质及其生物活性,利用硅胶柱层析、凝胶柱层析和半制备高效液相色谱对ASD发酵液的二氯甲烷粗提物进行纯化,运用核磁共振及高分辨质谱技术,结合文献报道数据对化合物的结构进行鉴定,利用X-射线单晶衍射验证鉴定结果;采用含药稀释平板法及菌丝生长速率法测定化合物对辣椒疫霉菌、大斑凸脐蠕孢菌和禾生刺盘孢菌等9种病原真菌的抑菌活性。结果表明,从ASD发酵液中分离获得已知活性抑菌物质为sulochrin和4,5-二甲基间苯二酚。其中,sulochrin对辣椒疫霉菌、大斑凸脐蠕孢菌和禾生刺盘孢菌有较好的抑制作用,4,5-二甲基间苯二酚只对辣椒疫霉菌具有较好的抑制作用,两者对灰葡萄孢菌、玉蜀黍尾孢菌和新月弯孢菌等6株致菌抑菌效果不明显或无抑制作用。     

糖化酶工业株的鉴定及糖化酶基因的克隆

对4种糖化酶工业株的rDNA片段进行克隆,在对比其rDNA-ITS1序列与GenBank数据库的基础上,结合形态学观察对菌株进行了鉴定。结果显示,4种菌株分别为黑曲霉、无花果曲霉、米曲霉和灰色小克银汉霉。通过Me-gAlign得到的进化树表明,前3种菌株亲缘关系较近,三者与灰色小克银汉霉的亲缘关系较远。进一步克隆了黑曲霉、无花果曲霉和米曲霉的糖化酶基因,并在毕赤酵母中实现了分泌表达。     

钙对赭曲霉毒素A(OTA)诱导拟南芥毒性的抑制作用

为丰富赭曲霉毒素A (ochratoxinA,OTA)的植物毒性及其作用机理,探究钙在OTA诱导的植物毒性调控作用机理,本研究采用添加外源Ca2+,钙离子螯合剂乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic acid,EGTA)及OTA等处理离体拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶片,通过形态学观察,叶片相对电导率、活性氧含量(reactive oxygen species,ROS)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的测定等研究钙对OTA诱导的拟南芥毒性的影响,结果表明,在一定浓度范围内(0～50 mmol/L),外源Ca2+单独处理,拟南芥叶片形态学无明显变化,EGTA与OTA分别处理均会引起拟南芥叶片失绿、坏死病斑的形成,而Ca2+与OTA共同处理,能显著抑制OTA诱导的拟南芥叶片失绿、坏死病斑的形成,EGTA加剧OTA的毒性作用;OTA处理使拟南芥叶片相对电导率升高,细胞膜通透性增大,外源钙能显著抑制OTA引起的拟南芥叶片相对电导率升高(P＜0.05),20 mmol/L Ca2+的抑制作用最强,抑制率为61.32％.此外,OTA处理使拟南芥叶片细胞ROS的爆发及MDA的积累,对拟南芥造成氧化损伤,钙能显著抑制OTA诱导的拟南芥ROS爆发(P＜0.05),减少MDA的生成,抑制率分别为29.7％和71.4％.研究结果说明OTA能诱导拟南芥的植物毒性,钙能显著抑制OTA诱导的拟南芥植物毒性,钙在拟南芥受外界胁迫中起重要作用.     

一株曲霉的一种中温糖化酶的纯化及其部分酶学特性

本研究从广西花坪自然保护区采集的土壤中筛选获得了一株产糖化酶丝状真菌菌株57-45,通过形态学观察和真菌内转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）序列比对分析,将其初步鉴定为曲霉属（Aspergillus sp.）的一个种。纯化真菌57-45所产的一种胞外糖化酶经过硫酸铵分级沉淀、疏水层析和阴离子交换层析三步蛋白质纯化步骤,得到在SDS-PAGE上约60kD的单一蛋白质条带,薄层层析分析表明该纯化的蛋白质水解可溶性淀粉的产物只有葡萄糖,证明该纯化的蛋白质为糖化酶。纯化的糖化酶Km值为1.9mg/mL,Vmax为4148μmol/（min·mg）,最适作用pH5.5,最适作用温度50℃,在同步糖化发酵中有应用的潜力。金属离子Fe3＋、Zn2＋、Cu2＋对酶活有较强的抑制作用,EDTA对酶活有较强的促进作用。本文结果将为进一步研究曲霉糖化酶的酶学特性提供新的材料。     

免疫亲和柱净化高效液相色谱荧光法测定调味品中赭曲霉毒素A

建立了免疫亲和柱净化高效液相色谱法测定调味品中赭曲霉毒素A。样品用甲醇与NaHCO3体积比为60:40的溶液提取,经免疫亲和色谱柱纯化,应用液相色谱法检测。结果表明,空白样品按照质量分数为1.0,20,50μg/kg添加赭曲霉毒素A,回收率为75.0%～102.0%,精密度小于15%,方法检测灵敏度为0.5μg/kg。免疫亲和柱净化高效液相色谱法测定调料中赭曲霉毒素A是一种简单、快速、准确的方法。