专家文库

黄涛,男,湖北随州人,农学博士。2000年本科毕业于华中农业大学畜牧专业,获农学学士学位;2006年研究生毕业于华中农业大学动物遗传育种与繁殖专业,获农学博士学位;2010年11月赴美留学,进行为期一年的科学研究。     

番茄乙烯信号转导相关基因剧EIN3（Le-EIL）的克隆和表达

根据拟南芥（Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)EIN3基因保守区序列设计简并引物，采用RT—PCR扩增从番茄(Lycopersicon esculentum)果实中得到一个486bp的同源片段。以此片段作为探针，从番茄果实cDNA文库中分离到一个拟南芥EIN3的同源基因的cDNA克隆，命名为Le-EIL。该克隆含有一个1845bp的开放阅读框，编码615个氨基酸。经同源分析，它与烟草TEIL基因的同源性为79％，与拟南芥EIN3,EIL2和EIL3的同源性分别为59％、56％、52％、46％。Le-EIL基因表达与番茄果实的成熟及乙烯生成情况具有较强的相关性。在普通番茄果实的不同成熟时期Le—EIL基因都有表达，并且随着成熟度的增加基因表达有明显的增强，在转色期和粉红期Le-EIL基因的表达最强，在全红期后减弱。在转反义ACS基因的转基因番茄果实中，只有开花后60d的果实中Le-EIL基因有微弱的表达，在其它成熟时期均没有表达。     

丝毛乌骨鸡胸肌和肝脏cDNA文库的构建与鉴定

摘要：了解肌肉组织和肝脏组织的基因类型，构建鸡肌肉组织和肝脏组织的功能基因表达谱在动物遗传育种中具有重要的意义。为比较基因组学的研究、功能基因组学的研究、QTLs定位等的动物分子育种做前期基础科研工作，研究以丝毛乌骨鸡(Gallus gallus )的胸肌和肝脏为实验材料，以Lambda ZAPⅡ为载体，构建了胸肌和肝脏的cDNA文库。同时，对这两个cDNA文库进行了噬菌体PCR鉴定和所提质粒的Eco RⅠ和XhoⅠ的双酶切鉴定。结果表明，胸肌和肝脏mRNA的OD260/OD280 分别为1.92和1.90。胸肌cDNA文库的滴度在3.6× 107 pfu/mL以上，重组率92%以上，插入片段平均大于1.5 kb。肝脏cDNA文库的滴度在3.4× 107 pfu/mL以上，重组率90%以上，插入片段平均大于1.4 kb。     

砂糖桔全长cDNA 文库的构建及病程 相关蛋白基因的克隆与分析

为从分子水平上了解影响砂糖桔生理代谢、生长发育、病虫害抗性和品质的众多基因,以无籽砂糖桔幼叶为材料,应用SMART技术构建了cDNA文库,检测文库发现其库容量达到1.36×106,重组率为95%,插入片段绝大多数分布在0.6~2kb之间,有36%的插入片段是全长cDNA。随机挑选224个克隆进行测序,获得了1个病程相关蛋白基因的全长cDNA序列。将基因序列提交Gen Bank,编号为KJ000019。基因的CDS长429bp,5′UTR为43bp,3′UTR为235bp,编码长度为143个氨基酸残基的蛋白。基因位于第8染色体上,有1个长度为193bp的内含子,基因编码的蛋白质分子量为15.4ku,等电点为6.96。该蛋白N端含有长度约为22aa的信号肽序列,指导蛋白分泌到细胞外;剩余部分是一个典型的Barwin保守结构域,具有几丁质酶的活性,在受到细菌、真菌侵染时可以分解部分真菌和细菌的细胞壁,发挥抗病作用。     

中国猪瘟兔化弱毒全基因组cDNA文库的构建和序列分析

根据已发表的猪瘟病毒（CSFV）序列设计并合了26条覆盖全长基因组的套式和半套式PCR引物。应用RT－PCR、Nested PCR和Half-nested PCR技术从试验感染的兔脾中成功地扩增出了各相应的cDNA重叠片段，分别克隆和测序，构建了C株全基因组cDNA文库，采用DNAstar软件对全基因组的核苷酸和氨基酸序列进行了同源性比较分析。CSF C株全基因组cDNA文库的构建为进一步构建全长感染性cDNA奠定了基础。     

油茶总RNA及mRNA的分离与纯化

利用改良的CTAB法，从富含本分类糖类等次生物质油茶叶片中分离出总RNA，并从总RNA中，通过两次过Oligo(dT）柱分离纯化得到mRNA。实验结果证明：所提取的RNA和mRNA完整，质量较高，并应用到油茶cDNA文库的构建。     

牛乳腺EST分析和牛基因索引功能的注释

乳腺功能基因组学研究需要收集一些合适的cDNA序列来对各种亚细胞不同发育和运作阶段的基因表达形式进行评估。为了更好的捕捉基因表达的范围，我们用混合的牛乳腺细胞建立了1个标准化的cDNA文库，产生了23202个EST，存放的基因库中。这些在牛基因索引中带有序列的EST集形成当前23883个试验性分析序列中的5751个。5751个中的87％仅含有1－3个乳腺来源EST。相反，18％的乳腺EST有12个基因与TC序列相似，这些结果说明标准化文库仅有部分作用，因为EST中，能在泌乳过程中大量转录的基因的减少可能是由于合并引起的。为了更好的评价乳腺文库中的新内容，并把它们增加到现存的注释中（包括牛序列元件、基因一致性序列和人类基因组序列），我们对人和鼠基因诱变和在TOGA的基因非线性化进行测试，并把其结果增加到现有BtGI注释中。35000多个牛元件明显超过了人类基因组序列，而且一些与人类表达序列相关的排列（3％）的位置是独立的。由于3445TC序列与任何数据无明显相似性，代表这些元件中的23种乳腺源cDNA克隆被进一步进行分析用于表达和新异。其只驻有一个克隆符合标准，这相相应基因是一个分化的异端或表达对牛来说是特异的。结果说明，用作标志哺乳动物的转座轴和鉴定这些基因的牛序列表达数据仅针对反刍动物。     

欧文氏杆菌CXJZ95-198基因组文库的构建

采用改良鸟枪法构建了草本纤维精制高效菌种Erwinia carotovora CXJZ95-198的基因组文库，结合透明圈法，筛选到了8个甘露聚糖酶基因阳性克隆，并采用PCR方法对它们进行了分析鉴定，结果表明它们含有同一个甘露聚糖酶基因。     

自贡大公古盐井中嗜盐菌的Na~+/H~+离子逆转运蛋白基因筛选

[目的]筛选四川自贡大公古盐井中嗜盐微生物的Na+/H+离子逆转运蛋白基因,并对其结构和编码蛋白进行分析。[方法]构建自贡大公古盐井中嗜盐微生物的Na+/H+离子逆转运蛋白宏基因组文库,通过与Na+/H+离子逆转运蛋白基因缺陷宿主菌株E.coliKNabc的功能互补筛选Na+/H+离子逆转运蛋白基因。并通过生物信息学方法对该基因的起始密码子、终止子、ORF、-35区、-10区和SD序列以及编码蛋白的分子量、等电点、疏水区域、跨膜区域、系统进化和耐盐特性进行分析。[结果]筛选到1个新的Na+/H+离子逆转运蛋白基因m-nha,该基因能够赋予E.coli KNabc在盐和碱性条件下良好生长的能力。[结论]由于m-nha编码蛋白在氨基酸序列和结构上不同于以往报道的Na+/H+离子逆转运蛋白,故鉴定该基因为1个新的Na+/H+离子逆转运蛋白基因。该研究结果对于理解古盐井中嗜盐微生物的嗜盐机制,开发利用古盐井中的基因资源及寻找新的耐盐基因具有重要的意义。     

水稻cDNA酵母表达文库的构建及重金属镉胁迫相关基因的初步筛选

提取经重金属胁迫处理的水稻幼苗总RNA并纯化mRNA,采用SMART技术反转录成cDNA,利用Gateway技术将cDNA构建到入门载体pDONR222后,再经LR反应重组到酵母表达载体pYES2-DEST52上,获得水稻cDNA表达文库。检测表明,所构建的cDNA文库能达到后续试验要求。使用重金属镉敏感酵母突变株ycf1Δ进行水稻中重金属镉耐受相关基因筛选,获得多个可以恢复表型的酵母单克隆。提取质粒并测序分析后可知涉及到水通道蛋白、蛋白酶抑制剂以及金属硫蛋白等不同基因,筛选所得基因即为水稻应答重金属镉胁迫的候选基因。