马铃薯（SolanumtuberosumL．）全基因组水平上LTR-逆转座子的鉴定与进化分析

LTR-逆转座子是构成基因组特别是植物基因组的重要组分。它们在寄主基因组的进化过程中起到重要作用。马铃薯是重要的经济作物和粮食作物,其全基因组序列的公布为进一步研究其遗传组成和演化提供了基础。本文以马铃薯全基因组序列为材料,用结构分析和同源比对的方法分离得到9318个完整的LTR_逆转座子,7281个非完整（trtmcated）LTR-逆转座子元件和3657个soloLTR元件。进一步研究表明,gypsy类转座子在距今两百万年（millionyearsago,MYA）时转座活性被抑制,而copia类元件活跃至今。马铃薯和番茄比较基因组学的研究表明,LTR-逆转座子序列变异率为18．73％,远高于基因序列的7．37％和CDS序列的5．01％。     

水稻PcG类基因 OsEMF2b T-DNA插入杂合突变体的细胞学研究

采用石蜡切片法对水稻OsEMF2b的T-DNA插入杂合突变体的花器官形态、雌雄蕊发育和种子形成等过程进行了细胞学研究。结果表明,OsEMF2b杂合突变体花器官形态和各部分的数量有变异,但花药和胚珠发育以及花粉和胚囊的育性正常。OsEMF2b杂合突变体出现一定比例的受精卵不分裂、胚胎发育延迟、胚胎畸形,胚乳游离核不能细胞化和胚乳细胞退化解体等异常现象,从而导致其结实率明显低于野生型。OsEMF2b基因可能在水稻的花器官形成和种子发育过程中具有重要的调控作用。     

稻曲病菌突变体B-726生物学性状分析及其T-DNA插入位点侧翼序列的克隆

【目的】分析稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱突变菌株B-726的生物学性状,分析其T-DNA插入位点的侧翼序列,克隆因外源基因插入被破坏正常表达的基因,为明确该基因在稻曲病菌致病过程中的作用奠定基础,并为稻曲病防治新途径的制定提供理论依据。【方法】通过测定突变菌株B-726生长速率、产孢能力及致病力检测,分析其生物学性状;Southern杂交分析B-726外源基因插入的拷贝数;利用HiTail-PCR 获得T-DNA插入位点的侧翼序列;运用RACE-PCR技术,克隆与插入位点毗邻的基因全长;用半定量RT-PCR分析该基因表达情况。【结果】突变菌株B-726与野生菌株P1相比致病力极显著下降,产孢能力、生长速率显著下降。Southern杂交结果显示T-DNA在菌株B-726中以单拷贝形式插入。经过序列分析发现,T-DNA插入在1个命名为Uvt-726上游344 bp处,半定量PCR结果表明,Uvt-726在B-726表达量较P1显著下降。【结论】克隆了1个可能与稻曲病菌致病力相关的基因,推断该基因在稻曲病菌致病过程中起着重要的作用。     

农杆菌介导球孢白僵菌转化体系的建立及突变体筛选

以球孢白僵菌(Beauveria bassiana)YB-06为受体菌株, 采用农杆菌介导的遗传转化方法,实现了农杆菌AGL1(pATMT1)介导的球孢白僵菌的遗传转化,并研究了转化介质和pH对转化效率的影响。结果表明:在采用28℃、200μmol/L的乙酰丁香酮(AS)、农杆菌浓度OD₆₀₀=0.8、孢子浓度为1×106个/ml、pH5.1~5.8时可实现T-DNA的插入转化。当转化体系pH5.3时,转化效率最高,达586个转化子/106分生孢子;不同共转化介质对转化效率影响明显, 玻璃纸和硝酸纤维素膜转化效率较高。对3000个转化子生长速度和产孢量等性状分析获得46个性状特异突变体。本文结果为进一步研究球孢白僵菌的生长发育、致病机理和毒力相关基因功能奠定了基础。     

利用与su1紧密连锁的Ac转座子构建玉米插入突变体库

以位于玉米第4号染色体短臂与su1紧密连锁的Ac转座子作为Ac供体,结合w22报道系,创建1 507个Ac远距离转座事件。利用基于Southern Blot的IPCR和基于酶切连接的Genome-Walking PCR方法,分离到其中56个独立的可遗传Ac/Ds(transposed Ac/Ds,tr-Ac/Ds)侧翼序列标签,补充了Ac/Ds转座插入突变体的数量。利用玉米B73的基因组序列,通过BLAST比对分析将trAc/Ds定位到了玉米基因组上,并分析了Ac/Ds插入位点附近DNA序列,其中51个tr-Ac/Ds插入序列为单拷贝序列,鉴定到39个trAc/Ds插入到了基因内部,12个Ac/Ds插入到基因间区域,进一步证明了Ac/Ds倾向于插入基因内部和低拷贝的基因组富集区。     

牛羊朊蛋白基因（PRNP）多态性与抗病性的研究进展

 朊蛋白（PRNP）是近年来造成人和部分哺乳动物传染性海绵状脑病(TSE)的主要根源,该基因的多态性显著影响了人和动物对TSE的易感性或抗病性。本文分析了朊蛋白基因及其编码蛋白的结构与功能;简要介绍了绵羊基因编码区突变与致病性的关系;系统分析了牛科动物启动子区域内23bp的插入/缺失、第一内含子区域内12bp的插入/缺失及其与疯牛病（BSE）抗病性的作用机制;全面总结了全球已经报道的牛科动物12和23bp插入/缺失的等位基因与单倍体频率,评价了其发病的可能性。该研究将为牛的分子育种提供指导。     

鸽痘病毒插入载体的构建

经PCR、克隆鉴定、酶切获得PPVZ带有PvuⅡ酶切位点的TK1基因片段。将带有PvuⅡ酶切位点的TK1基因片段与经相同酶切的PUC19载体片段连接,获得重组质粒PUC19-Z。用限制性内切酶NcoⅠ对阳性重组质粒PUC19-Z进行单酶切(TK基因内存在一个NcoⅠ位点),经PCR、克隆鉴定、酶切获得质粒pGJP-5带有NcoⅠ酶切位点的P7.5基因片段,将此片段与经同样酶切的PUC19-Z连接,经酶切和PCR鉴定,筛选出正向插入的重组质粒即为鸽痘病毒插入载体。     

T-DNA插入麝香百合的研究

[目的]获得麝香百合转基因植株。[方法]采用2步外植体法和农杆菌介导的T-DNA插入技术转化麝香百合。[结果]菌液浓度OD600值为0.6~0.8时浸染效果好,同时附加250 mg/L的AS可以提高转化效率,50 mg/L G418为抗性筛选最适浓度。对经过抗性筛选的百合转化植株进行PCR分子检测,部分转基因植株呈阳性,初步证明T-DNA已插入到百合基因组中。[结论]该研究为利用T-DNA插入技术筛选优良的百合新品种奠定了基础。     

烟草青枯菌Tn5突变体库的构建及突变位点分析

为了从烟草青枯菌全基因组范围内发掘致病性相关基因,采用电转化法构建了一个EzTn5转座子介导的烟草青枯菌TXLLJ14-3菌株插入突变体库,该突变体库包含1.2万个突变子,经烟草上的致病性检测,共得到216个无致病力或弱致病力突变菌株。利用TAIL-PCR扩增获得其中15个无致病力烟草青枯菌的Tn5侧翼序列,并对其插入位点进行了分析,结果表明,15个突变菌株的插入位点分别位于核苷酸水解酶、糖基转移酶、转座酶和合成酶等具有不同功能的基因上,这些基因受到干扰或破坏后,可能会抑制致病相关物质的表达或分泌,或者诱导烟草对病原菌产生抗性,从而表现出无致病力特征。     

小球藻紫外线诱变及高含油藻株筛选

采用反向 PCR 技术对东方百合（Oriental hybrid lily）T-DNA 插入突变株的侧翼序列进行扩增并进行序列分析。 结果表明： 6 个突变表型的植株都有 T-DNA 插入。 扩增到的 10 个序列长度大都在 500～900 bp 左右。 回收其中的 8 条亮带, 克隆测序后, 经 NCBI BLASTx 比对发现, 除了 B2 序列因为太短没有显著的同源性以外, 有 1个是未知功能的蛋白。 B1 是 Lys 家族转录调节因子; CM1 是 C 类细胞色素生成蛋白; CM2 是糖转运跨膜蛋白;D1 是特有的解旋酶家族; F1 是 rRNA 小亚基甲基转移酶; G1 是 Arac 家族转录调节因子。 表明这些基因可能与这些突变表型有关。