PCR法构建小鼠α-1,3-GT基因沉默载体研究

在已报道的shRNA序列前加上人类H1启动子,设计一段沉默小鼠α-1,3-GT基因的siRNA序列,针对该序列分段设计引物,完全采用PCR法将其连接起来,然后把该序列克隆到pGEM-T载体中,构建出针对小鼠α-1,3-GT基因的特异性沉默载体,为进一步获得α-1,3-GT基因沉默小鼠,构建异种器官移植用小鼠模型奠定了基础.     

玉米逆境响应基因ZmGST23克隆和表达分析

谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)是植物抗氧化系统的重要成员,在初生代谢、次生代谢、细胞信号转导及逆境响应等生物学过程中发挥着重要作用.本研究以GenBank中公布的玉米谷胱甘肽-S-转移酶23基因(ZmGST23)mRNA序列(GenBank登录号:NM_001111524)为依据,采用RT-PCR方法从玉米(Zea mays)自交系F83中克隆得到ZmGST23基因669 bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码222个氨基酸,蛋白分子量为24.84kD,理论等电点为5.68.保守结构域分析表明,该基因具有GSTs所特有的N端及C端结构域,并含有典型的G位点及H位点,属于Tau类谷胱甘肽硫转移酶.系统进化分析表明,ZmGST23编码蛋白与高粱(Sorghum bieolor)GST蛋白亲缘关系最近,且在不同物种间存在明显的种属特性.启动子序列分析结果显示,ZmGST23基因启动子区含有多个响应逆境及植物激素的作用元件,包括脱落酸(abscisic acid,ABA)响应元件、生长素(auxin,IAA)响应元件、赤霉素(gibberellin,GA)响应元件、厌氧响应元件、防御及逆境响应元件以及干旱诱导的MYB转录因子(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog,MYB)结合位点.胁迫诱导表达分析表明,ZmGST23的表达显著受干旱脱水、水涝、盐、ABA、IAA、GA、低温及高温等非生物胁迫的诱导.组织特异性表达分析表明,ZmGST23基因在幼芽和成熟叶片中表达量较高,在幼根、花丝、苞叶、雌穗及雄穗中表达量较低,存在明显的组织特异性.将ZmGST23基因片段连接至原核表达载体pEASY-E1中,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,用0.5 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ3-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达1～4 h后获得30 kD的诱导蛋白.本研究结果为进一步利用该基因进行玉米抗性改良提供了一定的理论依据.     

牦牛METTL14 CDS区克隆及表达谱分析

旨在克隆牦牛甲基转移酶样蛋白(methyltransferase-like protein 14,METTL14)基因的编码区(CDS)序列,探究其分子特征及时空表达规律。以大通牦牛脂肪组织cDNA为模板,通过克隆获得METTL14的完整CDS区序列,用生物学软件进行基因序列和蛋白质结构分析,利用qRT-PCR检测METTL14的时空表达规律。结果显示,大通牦牛METTL14的CDS区全长1 371 bp,共编码456个氨基酸;METTL14亲缘关系与野牦牛最近,与鸡和小鼠最远;氨基酸等电点是5.89,不稳定系数(Ⅱ)为52.02,GRAVY=-0.878,METTL14总体表现出强的亲水性;METTL14有1个大小为177 aa的MT-A70酶保守结构域,无信号肽与跨膜结构域;亚细胞定位与核定位预测分析都显示METTL14位于细胞核(69.60%)。推测METTL14共有40个潜在的磷酸化位点。METTL14蛋白高级结构由无规则卷曲(51.10%)、α-螺旋(33.11%)、延伸链(11.84%)和β-转角(3.95%)相互连接而成。METTL14与甲基化修饰相关蛋白相互作用,主要参...     

结球甘蓝抗虫转基因植株及其后代的抗性表现

应用农杆菌介导法将含有豇豆胰蛋白酶抑制剂 (CpTI)基因和新霉素磷酸转移酶 (NPTⅡ )基因的重组质粒导入结球甘蓝栽培品种春甘蓝“鸡心 2 3”和秋甘蓝“黑叶头”。对转基因当代植株 (T0 )及其自交后代 (T1、T2 、T3)群体进行卡那霉素抗性、抗虫性鉴定和分子检测。经PCR DNA分子杂交检测 ,确认抗虫基因———豇豆胰蛋白酶抑制剂基因已整合到受体植株的基因组中 ,并在有性生殖过程中传递给后代。卡那霉素抗性和抗虫性状在T0 代植株上得到表达 ;T1代植株中发生分离 ;T2 代中呈现出 3种不同类型的株系 :抗性纯合、杂合型和敏感性纯合株系 ;从T3 代中获得卡那霉素抗性和抗虫性纯合的株系。试验结果显示 ,卡那霉素抗性和抗虫性状在转基因植株自交后代中的表现基本符合显性单基因的分离规律。在T2 、T3 代抗虫性纯合的株系中 ,鳞翅目小菜蛾、甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的 1～ 2龄幼虫校正死亡率为 6 %～ 10 0 % ,从中选出一批校正死亡率达 80 %左右的单株     

水稻品种对褐飞虱代谢酶的影响

用水稻敏感品种TNl和具有不同抗性基因的品种Mudgo,ASD7和Rathu Heenati饲养稻褐飞虱(Nilaparvata lugens)，研究不同品种对褐飞虱体内酯酶、谷胱甘肽转移酶和多功能氧化酶氧—脱甲基活性的影响。结果表明，褐飞虱在3种抗性品种上饲养一代后，其酯酶活性与敏感品种上的试虫相比没有显差异。然而，取食Mudgo和ASD7的雌成虫之间酯酶活性达到显性差异；取食Mudgo和Ruthu Heenati的雄成虫酯酶的Km值分别为取食TNl的2．78和2．58倍。褐飞虱体内酯酶活性还因其生物型的不同而异。对褐飞虱生物型1和生物型2个酯酶活力分布的测定结果表明，生物型2的雌、雄成虫酯酶活性均显低于生物型1的。研究还表明，在ASD7与Rathu Heenati上饲养一代后，褐飞虱雌、雄成虫GST的活性显高于取食TNl和Mudgo的个体，但抗性品种对褐飞虱成虫的多功能氧化酶氧—脱甲基活性没有明显影响。因此，水稻品种对褐飞虱代谢酶的影响因品种的特性，代谢酶的类型，甚至褐飞虱的性别而异。中对其可能的机制进行了探讨。     

外源基因在不结球白菜转基因植株后代中的表达

应用农杆菌介导法将含有豇豆胰蛋白酶抑制剂基因和新霉素磷酸转移酶基因的重组质粒导入不结球白菜地方品种———“中脚黑叶”和“矮脚黑叶”中 ,获得抗虫转基因植株。卡那霉素抗性和抗虫性在转基因植株自交后代T1代植株中发生分离 ;在T2 代中出现 3种不同类型的株系 :抗性纯合、杂合型和敏感性纯合株系。卡那霉素抗性和抗虫性在转基因植株自交后代中的表现基本符合孟德尔显性单基因的分离规律。从T2 、T3 、T4代中选择出抗虫性纯合株系 ,并获得一批对 1～ 2龄鳞翅目小菜蛾、斜纹夜蛾幼虫的校正死亡率达 6 0 %左右的单株     

寄主植物对棉铃虫体内解毒酶活性的影响

通过离体酶活性测定 ,研究取食小麦、豌豆等寄主植物和人工饲料对棉铃虫羧酸酯酶、谷胱甘肽 S-转移酶和乙酰胆碱酯酶活性的影响。结果表明取食不同寄主植物的棉铃虫体内羧酸酯酶活性不仅存在量的差异 ,而且存在质的差异 ,寄主植物对棉铃虫谷胱甘肽 S-转移酶、乙酰胆碱酯酶活性有显著影响     

菜薹蛋白精氨酸甲基转移酶基因BrcuPRMT5的克隆及表达分析

以‘油青49’和‘油青甜菜薹80’菜薹茎尖为材料,采用RT-PCR和RACE技术克隆获得组蛋白甲基转移酶基因Brcu PRMT5的全长cDNA和gDNA序列。BrcuPRMT5 cDNA序列全长为2 117 bp,其中完整开放阅读框为1 929 bp,编码642个氨基酸,相对分子量为71.55 kD,理论等电点(p I)为5.87;多序列比对结果表明,Brcu PRMT5编码的氨基酸序列含有高等植物PRMT5基因1个高度保守的结构域;系统发育分析结果显示与大白菜、油菜及甘蓝的亲缘关系最近;亚细胞定位软件分析得知,Brcu PRMT5蛋白无跨膜区域,可能定位于线粒体中;对应的gDNA全长为4 151 bp,含有23个外显子和22个内含子,最长的外显子长度为140 bp,内含子的长度范围为50~150 bp。利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术分析基因的表达,BrcuPRMT5在菜薹不同组织中均有表达,其中在花中表达量最高,叶次之,根中最低;BrcuPRMT5从苗期至完全抽薹开花期的表达量呈现上升趋势。BrcuPRMT5在菜薹花发育过程中可能起一定的调控作用。     

马铃薯地上部绿色组织中糖苷生物碱合成调控的研究

为提高马铃薯品种(系)地上部分糖苷生物碱(SGAs)的含量,增强其抗逆性并改良块茎的品质。克隆了马铃薯茄啶鼠李糖基转移酶基因(sgt3)cDNA和1,5–二磷酸核酮糖羧化酶小亚基基因启动子(rbcS P);对sgt3亚细胞定位预测显示,该蛋白不具有叶绿体转运肽、线粒体导肽和分泌信号肽序列,推测可能位于细胞质;将克隆的sgt3 cDNA片段及rbcS重组到pCEPSP载体上,构建了具有草甘膦抗性标记的绿色组织特异表达sgt3基因植物表达载体。通过农杆菌介导法对马铃薯品种‘陇薯3号’和‘夏波蒂’进行转化,共获得了12株抗草甘膦的阳性转基因植株。对转基因植株的目的基因表达水平和SGAs含量分析发现,地上部sgt3基因相对表达量较未转化植株提高1.3~3.0倍,SGAs含量增加20%~37%,而转基因植株的块茎中SGAs含量变化不显著。本研究的结果为进一步培育枝、叶中高SGAs而块茎中低SGAs的马铃薯抗性品种提供了理论依据。     

茶树CsSNAT基因的克隆与表达分析

为明确茶树SNAT基因的序列特征和表达特点,在茶树转录组测序的基础上以茶树(Camellia sinensis)品种舒茶早为试验材料,通过SMART^TM RACE技术克隆茶树褪黑素合成途径中关键限速酶5-羟色胺-N-乙酰转移酶CsSNAT基因的cDNA全长序列,并分析其基因结构和表达模式。结果表明,CsSNAT基因序列全长1 014 bp,其中包含742 bp的完整开放阅读框(ORF),编码247个氨基酸,预测等电点7.64,蛋白分子量27.36 kDa。氨基酸序列比对显示,CsSNAT蛋白与其他高等植物的SNAT蛋白具有较高同源性,与葡萄 VvSNAT(CBI31163)同源性最高,为66.19%。诱导蛋白最佳条件为温度28℃,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.5 mg·L^-1,诱导时间6 h,在上清液中可获得大量分子量为66 kDa的可溶性融合蛋白。实时定量 PCR 分析表明,CsSNAT在褪黑素处理6 h后表达量最高,为对照的3倍;茶尺蠖取食6 h后,CsSNAT表达显著上调。不同激素处理结果显示,CsSNAT受脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和水杨酸(SA)诱导表达。本研究结果为5-羟色胺-N-乙酰转移酶功能研究奠定了一定的基础。