小鹅瘟病毒荧光RPA恒温快速检测方法的建立与应用

旨在建立一种以重组酶聚合酶扩增技术（RPA）为基础的快速检测方法,用于小鹅瘟病毒的快速检测。小鹅瘟是一种常见的水禽传染病,严重危害我国养鹅业的健康发展。为了快速准确对小鹅瘟进行诊断,减少该病的危害,本研究以小鹅瘟病毒VP3基因保守片段为靶点,利用重组酶聚合酶扩增技术（RPA）建立了一种准确高效的小鹅瘟病毒RPA恒温快速检测方法,并对检测方法的灵敏度、特异性进行评价,并与传统PCR和传统RT-PCR方法进行比较。结果表明,该检测方法具有较高的灵敏度,可检测到10 copies/μL的病毒核酸;具有良好的特异性,只特异性地扩增鹅细小病毒,而与鹅副黏病毒、鹅源鸭瘟病毒、小鹅流行性感冒病毒、鹅副伤寒病毒、大肠杆菌和曲霉菌均未发生交叉反应;同时该方法重复性检测的变异系数低于6%,具有很好的重复性。阳性符合试验表明该检测方法与荧光定量PCR符合率为99%。该方法可以很好地应用于小鹅瘟的大规模临床样本检测,为小鹅瘟病毒的高通量检测和流行病学调查提供技术手段。     

鱼类神经坏死病毒纳米探针的制备与特征分析

为了快速检测鱼类神经坏死病毒,本研究设计了病毒特异性的发夹型探针,经硫醇修饰后与纳米银溶胶结合,制备了鱼类神经坏死病毒纳米探针（Ag-NNV）,并使用透射电镜、多功能酶标仪、表面增强拉曼光谱仪等对纳米探针Ag-NNV的表征及发夹型探针在纳米银粒子表面的覆盖率进行了测定和分析。结果表明,裸露的纳米银粒子为球形,平均直径50 nm;制备的纳米探针颗粒为球形,平均直径90 nm。纳米银粒子和纳米探针在溶液中均具有良好的分散性。平均每个纳米银粒子表面结合发夹型探针约100条,单位表面积的探针覆盖量为0.56 pmol/cm2。该纳米探针制备简便,适合用于表面增强拉曼散射法对鱼类神经坏死病毒进行快速检测。     

血清1型鸭甲型肝炎病毒实时定量PCR检测方法的建立与初步应用

为建立了一种可检测血清1型鸭甲型肝炎病毒（DHAV-1）的实时定量PCR方法,根据GenBank中DHAV-1 5,非编码区的保守区,设计合成1对引物和1条TaqMan探针,以构建的重组质粒作为标准品,绘制标准曲线,并对所建立方法进行了特异性、敏感性和可重复性试验以及临床病料检测初步应用。结果,该方法与血清3型鸭甲型肝炎病毒、鸭瘟病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、呼肠孤病毒、传染性支气管炎病毒等无交叉反应性;最低可以检测到10copies/μL;组内和组间变异系数均小于3%;临床病料的检测结果与测序检测结果一致。结果表明,所建立的实时定量检测方法具有特异、敏感、稳定等优点,可用于DHAV-1的快速检测与定量分析。     

不同植物LDOX/ANS基因的生物信息学分析

花青素是一类重要的植物次生代谢产物。本文采用生物信息学的方法对已在GenBank上登录的拟南芥、西洋梨、苹果、桃、葡萄、芥菜、菊花新品种和水稻等植物的无色花青素双加氧酶/花青素合成酶(LDOX/ANS)基因的核酸及氨基酸序列、组成成分、导肽、信号肽、跨膜结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二级结构、三级结构及功能域等进行预测和推断。结果表明,ORF除了桃和菊花新品种为500bp左右之外,其它几种植物都在1070bp左右,分子量均为4kD左右,理论等电点均低于7,说明LDOX/ANS呈酸性。Glu、Leu和Val是这些植物共有的主要氨基酸。核苷酸同源性比对结果显示,拟南芥LDOX/ANS与其它植物LDOX/ANS的同源性较高;8个物种的LDOX/ANS基因被分为两个大类,单子叶植物水稻LDOX/ANS基因被单独分为一类,其它的均聚成一大类。研究还发现这些植物的LDOX/ANSN端不存在导肽和信号肽,无跨膜结构域,肽链表现为亲水性。蛋白质二级结构中最主要的结构元件是α-螺旋和无规则卷曲,包含一个20G-FeⅡOxy功能结构域。通过此次研究,希望为今后深入研究该类酶的功能和结构特征提供依据。     

烟草花叶病毒实时荧光定量PCR检测体系的构建

[目的]防止隐症携带烟草花叶病毒(TMV)的烟苗移栽到大田造成产量损失。[方法]根据TMV的外壳蛋白(coat protein, CP)基因保守序列设计引物及探针,通过绘制标准曲线、重复性、特异性及灵敏性分析,建立了一种TMV的TaqMan-qPCR检测方法。[结果]该方法特异性好,与其他常见的烟草病毒无交叉反应;灵敏度高,检测下限可达到4.53×10¹ copies/μL,比常规RT-PCR检测灵敏度提高了10倍;建立的标准曲线斜率为-3.299,决定系数(R²)为0.993 3,扩增效率为100.97%,且循环阈值(Ct)与质粒标准品浓度之间线性关系良好,重复性试验结果可靠。[结论]利用建立的TaqMan-qPCR检测方法与常规RT-PCR检测方法同时检测烟苗样品,检测结果一致,进一步验证了荧光定量PCR方法的可靠性。     

0.05％核苷酸对芝麻的增产效果研究

2010年在河南省项城市进行随机区组试验,研究叶面喷施0.05％核苷酸(桑兰990A)对芝麻的增产效果.结果表明:与喷清水相比,喷施0.05％核苷酸(2mL/L)、0.05％核苷酸(2mL/L)+红A硼(2g/L)处理的芝麻株高分别增加5.40 cm、12.80 cm,蒴果数增加5.96个、14.94个,株粒数增加46...     

基于荧光探针技术检测30种农兽药及其二元、三元组合对CYP3A4酶的联合毒性

在农业生产中混合使用多种农药或兽药越来越普遍,但因药剂联合毒性效应的不确定性而对人体健康产生严重威胁。本文基于酶抑制法原理,利用荧光探针 NEN (N-乙基-1,8-萘二甲酰亚胺) 直接检测CYP3A4酶的活性,建立了广谱筛查混合农兽药联合毒性效应的方法,并以常用的30种农兽药及其典型的23种二元和26种三元组合为研究对象,检测了农兽药混合物对CYP3A4酶的联合毒性效应,其中标准质量浓度根据食品安全国家标准规定的农兽药最大残留限量确定。结果表明:3种质量浓度梯度下对CYP3A4酶均具有协同作用的混合农兽药组合有克百威 + 多菌灵、克百威 + 吡虫啉、啶虫脒 + 烯酰吗啉、吡虫啉 + 多菌灵、氯氰菊酯 + 啶虫脒 + 烯酰吗啉、克百威 + 啶虫脒 + 多菌灵、吡虫啉 + 啶虫脒 + 多菌灵、吡虫啉 + 啶虫脒 + 烯酰吗啉、毒死蜱 + 啶虫脒 + 多菌灵和联苯菊酯 + 啶虫脒 + 多菌灵。当单一农兽药对CYP3A4酶活性的抑制率较高时,与其他农兽药混合后联合毒性效应呈拮抗作用,而当单一农兽药对酶活性的抑制率低于2%时,则与其他农兽药混合后联合毒性效应呈现不确定性。农兽药组合在低浓度下对CYP3A4酶的联合毒性往往存在较强的协同作用,但随着浓度的升高,联合毒性效应从协同变为拮抗作用。分析农兽药与CYP3A4酶之间的构效关系可知,含有芳氯基团的数量与对酶活性的抑制程度成正相关,含有3个芳氯及以上基团的农兽药对CYP3A4酶活性的抑制作用最为显著,抑制率在30%以上,如百菌清、毒死蜱、甲基毒死蜱、咪鲜胺等;含有2个芳氯或“强吸电子基团 + 1个芳氯”基团的农兽药,对CYP3A4酶活性的抑制作用较强,抑制率在18%以上,如苯醚甲环唑、哒螨灵和异菌脲等。具有氨基甲酸酯基团的农兽药单独作用于CYP3A4酶毒性较小或几乎没有毒性时,与其他农兽药混合后显示较强的协同作用。本研究建立的检测方法为广谱筛查混合农兽药联合毒性提供了新思路,检测结果可为进一步在细胞和动物水平制订农兽药混剂的风险评估方案提供依据。     

外源核苷酸在动物饲养中的作用

1胃肠道功能促进消化器官功能的发挥。体外试验发现,添加核苷酸后小肠上皮细胞中碱性磷酸酶、蔗糖酶活性上升;体内试验发现,日粮中添加核苷酸与核苷混合物将对肠内碱性磷酸酶、亮氨酰基肽酶、麦芽糖酶、蔗糖酶和乳糖酶的含量和活性产生影响,小肠黏膜中总蛋白酶活力提高,且对十二指肠及空肠近端的酶活性影响较大。     

等离子激元单颗粒纳米生物探针界面调控与应用

本研究主要利用不同形貌、尺寸的单个等离子激元纳米颗粒为基底,实现了高灵敏的生物传感,检测灵敏度达到单分子水平;结合DNA特异杂交与折纸技术,实现生物分子在等离子激元界面状态的精确调控,并对其形态转变的动力学过程进行观测。经过多年的研究,我们在单颗粒水平上构建了一系列基于等离子激元的高灵敏高选择性纳米生物传感器,这些创新成果推动了纳米生物传感分析化学的发展。     

双(1-芘基)吖嗪的合成及其金属离子识别性能测试

采用1-芘甲醛和水合肼在二甘醇二甲醚和乙醇混合溶剂中合成具有荧光探针的双(1-芘基)吖嗪分子。将该配体与不同金属离子溶液配合,发现该荧光探针对Cu~(2+)具有良好的选择性,最低检出限为10~(-8)mol/L。